黄芩苷对老年大鼠脾切除后认知功能障碍的影响

张建楠，周红梅，蔡靓羽，蒋晨浩

（南京中医药大学附属无锡医院，江苏 无锡 214071）

术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指术前无精神异常的患者，在术后出现包括认知、学习、记忆、思维活动等方面的障碍，是手术后中枢神经系统（central nervous system,CNS）并发症之一。一般认为POCD是在中枢神经退行性病变的基础上，由多种类型的应激刺激，例如手术、麻醉、药物等，诱发或加重神经退行性病变以及神经元凋亡[1]。

研究发现，术后认知功能障碍的病变主要集中在大脑的海马区域，海马对于学习、记忆、认知的功能至关重要，但易受癫痫，局部缺血、缺氧或炎症的损害[2]。尤其是NMDA受体亚型NR2B在此过程中起到了重要作用。NR2B通过调控NMDA受体和AMPA受体的膜转运及突触传递过程，从而影响学习与记忆功能。

手术创伤可以产生炎症反应。正常时，促炎细胞因子（IL-1β、IL-2、IL-6、TNFα）和抗炎细胞因子（IL-4、IL-10）表达量趋于动态平衡，而在手术应激等情况发生时，海马区域的炎症因子和抗炎细胞因子的失衡会造成中枢神经(CNS)发生炎症[3-4]，从而可能造成与海马功能变化相关的POCD。

黄芩苷是从中药黄芩的干燥根茎中提取的一种黄酮类化合物，是黄芩的主要药理成分，具有抗病毒、抗炎、抗凋亡、抗氧化应激等多种作用[5-8]。它可透过血脑屏障，通过抗炎、抗凋亡等发挥神经保护作用，有效保护脑缺血等损伤。

本课题通过构建脾切除术后POCD老年大鼠模型观察黄芩苷能否模型大鼠的认知功能，观察大鼠炎症因子的水平及海马NR2B的表达，探讨黄芩苷保护术后认识功能的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂：黄芩苷（上海金穗生物科技有限公司）；10%水合氯醛溶液（Wabcan，ST1002）；RT逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（TOYOBO，日本）；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，ml002095、ml037361和ml002293)等；主要仪器：荧光定量PCR仪（Steponeplus公司，德国）；Y形迷宫测试仪（深圳瑞沃德公司）；SPECTRA max Plus 384酶标仪（Molecular Devices，美国）等。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物及分组

12月龄雄性老年SD大鼠60只（上海斯莱克动物中心提供），饲养于SPF实验条件下。对大鼠进行随机分为5 组，每组12只（n=12），分别为脾切除手术组（OP group）、假手术组（Sham group）、黄芩苷低剂量组（Baicalin A group）、黄芩苷中剂量组（Baicalin B group）、黄芩苷高剂量组（Baicalin C group）。

1.2.2 药物处理

Baicalin A、Baicalin B、Baicalin C组的老年大鼠，于术前一天分别腹腔注射，给予不同浓度（低，中，高）的黄芩苷（Baicalin A：50 mg/kg/d；Baicalin B：100 mg/kg/d；Baicalin C：200 mg/kg/d）；OP、Sham组的老年大鼠，腹腔注射等量的生理盐水。

1.2.3 建立脾切除模型

Sham组的实验动物仅进行腹腔麻醉，不实施脾切除手术；其他组别实验动物均进行脾切除手术。使用水合氯醛对实验大鼠进行麻醉后，置于手术操作台上，取腹部正中切口，游离脾脏，脾蒂双重结扎后切除脾脏，确认止血完善后缝合腹部。术后待大鼠麻醉恢复后放回各自笼中饲养。

1.2.4 Y迷宫检测动物认知功能

于术前、术后第1、第3、第7天分别各组大鼠进行新异臂实验，来检测老年大鼠的空间探索及记忆能力。Y-迷宫共3个臂，各臂夹角为120°，每个臂的尺寸50 cm×11 cm×20 cm（长×宽×高）。顶部中心安装摄像头，对大鼠的探索行为进行记录，3个臂被命名为：起始臂（start）、新异臂（novel）和其他臂（other）。训练阶段，新异臂被阻挡，大鼠从起始臂放入，让其在起始臂和其它臂之间自由探索15 min。结束后使用10%的酒精对三臂进行擦拭并吹干，以排除大鼠动物气味对后续实验的干扰。根据Dellu的报道，本实验间隔2 min后开始测试阶段[9]。挡板被打开，将大鼠放入迷宫起始臂，允许大鼠在3个臂之间自由探索5 min并对其活动进行录像。两阶段均待大鼠走入中心区（central）后才进行录像及Anymaze 5.1.1软件分析，主要分析指标为计算大鼠在各个臂中的停留时间或穿梭次数占总探索时间或总穿梭次数的百分比，这两个指标被用来衡量动物新异性探索行为。

1.2.5 ELISA检测血清中相关细胞因子水平

分别在术前、术后第1、第3、第7天，分别静脉采集各组大鼠血液,分离血清，ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6各细胞因子水平。

1.2.6 RNA抽提和RT-qPCR

取大鼠新鲜脑组织剥离海马部分，保存于-80℃，利用RT-PCR检测海马组织中的NR2B。Trizol-离心柱法提取细胞总RNA，使用Agilent 2100生物分析仪评估提取的RNA的质量，RNA完整性值（RINs）高于8。使用TaKaRa逆转录试剂盒合成cDNA后，使用TIANGEN SuperReal PreMix Plus（with SYBR Green I）试剂盒及CFX connect Real-Time PCR System（Steponeplus 公司，Germany）进行RT-qPCR。采用Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1分析软件及2-ΔΔCT方法定量分析扩增曲线及溶解曲线。

2 结 果

2.1 黄芩苷可以改善脾切除老年大鼠空间探索和记忆认知功能

2.1.1 术前各组别老年大鼠的空间探索和记忆认知功能无显著差异

图a A.术前测试阶段大鼠分别在三臂中停留时间的百分比；B.术前测试阶段大鼠分别在三臂中穿梭的次数；C.术前测试阶段各个组别的大鼠运动轨迹热点图。

如图a所示，在术前对各组别大鼠进行Y迷宫测试。测试阶段大鼠在新异臂中的停留时间及在各臂中的穿梭次数并没有明显的差别。

2.1.2 术后1天各组大鼠行为学的比较

图b A.术后1天测试阶段大鼠分别在三臂中停留时间的百分比；B.术后1天测试阶段大鼠分别在三臂中穿梭的次数； C.术后1天测试阶段各个组别的大鼠运动轨迹热点图。

如图b所示，术后第一天各组大鼠在各臂停留时间的观察中发现，Sham组在新臂中停留的时间要明显高于OP组及各剂量黄岑苷组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在起始臂的停留时间中发现，Sham组大鼠的停留时间要明显低于其余各组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在异臂的观察中发现，OP组及中剂量黄岑苷组大鼠的停留时间要高于Sham组，而Sham组及高剂量黄岑苷组的大鼠其停留时间要明显低于OP组；在穿梭次数的观察中则发现，Sham组大鼠在新臂中的穿梭次数要明显高于其余各组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Sham组大鼠在起始臂的穿梭次数要明显低于其余各组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在新异臂的观察中则发现除了中剂量黄岑苷组大鼠的穿梭次数要明显高于Sham组之外，差异有统计学意义（P＜0.05），其余各组之间无明显差异。

2.1.3 术后第3天各组大鼠行为学的比较

图c A.术后3天测试阶段大鼠分别在三臂中停留时间的百分比；B.术后3天测试阶段大鼠分别在三臂中穿梭的次数；C.术后3天测试阶段各个组别的大鼠运动轨迹热点图。

如图C所示，术后第三天的各臂停留时间的观察中发现，不同剂量黄岑苷组及OP组大鼠在新臂的探索时间要显著低于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05），其中高剂量黄岑苷组大鼠在新臂中停留的时间要高于OP组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在起始臂的观察中发现，除Sham组外，其余各组大鼠在新臂中停留的时间均要高于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在关于穿梭次数的观察中发现，Sham组及中、高剂量黄岑苷组的大鼠在新臂中的穿梭此时要明显高于OP组，差异有统计学意义（P＜0.05），而OP组及低剂量黄岑苷组的穿梭次数要明显低于Sham组；同时OP组及低剂量黄岑苷组大鼠在起始臂的穿梭次数要明显高于Sham组、中剂量黄岑苷组以及高剂量黄岑苷组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在异臂中，OP组及低剂量黄岑苷组要高于Sham组。

2.1.4 术后第7天各组大鼠行为学的比较

图d A.术后7天测试阶段大鼠分别在三臂中停留时间的百分比；B.术后7天测试阶段大鼠分别在三臂中穿梭的次数；C.术后7天测试阶段各个组别的大鼠运动轨迹热点图。

如图d所示术后第7天各臂停留时间的观察中发现，Sham组、中剂量黄岑苷组以及高剂量黄岑苷组其在新臂中的停留时间要明显高于OP组及低剂量黄岑苷组，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组大鼠在起始臂和异臂中的停留时间要明显低于停留在新臂的时间；尤其是低剂量黄岑苷组在起始臂中的停留时间要明显低于OP组及Sham组；而在异臂的观察中则只有高剂量黄岑苷组大鼠的停留时间要低于OP组，其余无统计学差异。

2.2 不同浓度黄芩苷对于术后大鼠血清TNF-α，IL-6，IL-1β的影响

2.2.1 不同浓度黄芩苷对术后大鼠血清TNF-α的影响

如图所示，在术前各组大鼠血清中TNF-α的表达没有差异。术后一天各组血清中TNF-α的表达明显高于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05）；术后第3天，各组TNF-α的表达仍显著高于Sham组，但其中中剂量黄岑苷组及高剂量黄岑苷组的TNF-α要明显低于OP组，差异有统计学意义（P＜0.05）；术后第七天，Sham及不同剂量黄岑苷组中TNF-α的表达要明显低于OP组，提示了黄岑苷尤其是中高剂量的黄岑苷可能具有下调TNF-α表达的作用。

2.2.2 不同浓度黄芩苷对术后大鼠血清IL-6的影响

如图所示，在术前各组大鼠血清中IL-6的表达没有差异。术后1天各组血清中IL-6的表达明显高于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05）；术后第3天，各组TNF-α的表达仍显著高于Sham组，不同剂量黄岑苷组中的IL-6相较于OP组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），但和Sham组相比仍然升高明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；术后第七天，OP组及低剂量黄岑苷组的IL-6浓度要明显高于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05），中剂量及高剂量黄岑苷组的IL-6浓度要低于OP组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2.3 不同浓度黄芩苷对术后大鼠血清IL-1β的影响

如图所示，在术前各组大鼠血清中IL-1β的表达没有差异。术后第一天，黄岑苷各组的IL-1β浓度要明显高于Sham组，差异有统计学意义（P＜0.05），但显著低于OP组，差异有统计学意义（P＜0.05）；术后第三天，各组的IL-1β的浓度和术后一天相似；术后第七天，OP组及低剂量黄岑苷组的IL-1β浓度要高于Sham组,而中、高剂量黄岑苷组的IL-1β的浓度则明显低于OP组。这提示了黄岑苷可能具有降低术后IL-1β表达的作用。

2.3 荧光定量PCR检测大鼠海马组织中NR2B的mRNA水平

如图6所示，在术前的时间点，各组别NR2B的mRNA水平基本一致；在术后第一天的观察中发现：与Sham组相比，各组NR2B mRNA的水平显著下降，具有统计学意义；中、高剂量的黄芩苷组中NR2B的水平虽然下降，但是仍要高于OP组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在术后第三天的观察结果与第一天相似；在术后第七天的观察中发现，各组NR2B的水平相较于前两天的观察明显升高，中、高黄芩苷组NR2B的水平要高于OP组，差异有统计学意义（P＜0.05），而低剂量黄芩苷组的NR2B浓度要低于sham组，且具有统计学差异。

图6 荧光定量PCR检测术前，术后1，3，7天各组大鼠海马组织中NR2B的mRNA水平。

3 讨 论

POCD的发生严重影响患者的生活质量，并导致残疾和死亡的高风险[10-11]。随着人口老龄化的加速，POCD已成为术后严重影响生活质量的一大问题。而POCD的发生机制众多，其中Cibelli等人认为POCD的发生哈海马区炎性物质有关[12]，在他的实验中发现大鼠术后海马区微胶质细胞增多，IL-1β表达水平显著增高；而在IL-1β受体缺失大鼠脑内并没有发生。Rosczyk等人[13]发现老年大鼠术后海马组织中IL-1βmRNA水平有明显增加且，且在术后认知功能检测中表现出一定的影响。这提示了术后认知功能的损伤与脑内的炎症介质密切相关。在本研究中，我们通过脾切除术后老年大鼠模型的建立，通过行为学检测大鼠认知功能，通过检测脑内炎性因子及NR2BmRNA的表达，评估黄芩苷是否能够通过调节炎性物质的表达，改善脾切除大鼠术后的认知功能。

根据实验结果发现：中、高浓度黄芩苷可以在一定程度上改善脾摘除手术后大鼠短期内的认知功能。其中值得关注的是，在术后1天的时间点，高浓度的黄芩苷可以在一定程度上改善大鼠在在Y迷宫中的辨别探索能力和认知记忆能力。而在术后7天，随着时间推移，认知记忆能力的恢复，各组间大鼠的认知功能并没有明显差异。

另外，黄芩苷可以在一定程度上减少海马组织炎性因子的释放。实验发现黄芩苷可以明显降低TNF-α、IL-6以及IL-1β的表达，并且对于炎症因子表达的抑制呈剂量相关性。在对于NR2BmRNA的观察中发现，对照组大鼠脑内NR2BmRNA浓度急剧下降，黄芩苷可以避免术后NR2BmRNA在脑内的降低。

NR2B作为NMDA受体的调节亚单位，是调节长时程增强（LTP）现象及突触可塑性的重要部分，众多电生理实验证明NMDA受体能够介导LTP现象及调节突触可塑性过程[14-15]。中、高剂量黄芩苷处理组的老年大鼠在术后第1天和第3天NR2B水平开始有逐步恢复，术后第7天几乎恢复至正常水平，这提示我们黄芩苷处理能够提高NR2B转录及翻译合成水平，而黄芩苷抑制炎症因子的机制可能和NR2BmRNA的作用有关。

综上，黄芩苷可以通过降低术后炎症因子如TNF-α，IL-6，IL-1β的表达，并提高NR2B转录及翻译合成水平，从而改善POCD模型大鼠的术后认知功能障碍。