泛素结合酶抑制剂对猪精子获能状态及精卵结合能力的影响

程咪咪，汪秋月，吕艳秋，金 一

（延边大学农学院，吉林延吉 133000）

泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System，UPS）介导的蛋白降解是通过小分子伴侣蛋白泛素（Ubiquitin，Ub）共价连接，对靶蛋白进行稳定、可逆的翻译后修饰，负责执行这个调控过程的关键组分包括泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）以及去泛素化酶（DUB）和26S 蛋白酶体[1-3]。E2 具有高度保守的泛素结合结构域（UBC），UBC 上有象征活性的半胱氨酸位点，可以接受被 E1 激活的Ub，并与Ub 之间形成硫酯键。随后，Ub-E2 与已识别待降解靶蛋白的E3 相结合，E3 介导Ub 从E2 转移到靶蛋白上，E2 和E3 继续重复上述过程，直到靶蛋白上的多个Ub连接成一条多聚链，最后该靶蛋白被26S 蛋白酶体识别和降解。Uev1A 属于E2 家族的一员，因为不存在活性E2 所必需的半胱氨酸位点，所以只能与Ubc13 结合形成Ubc13-Uev1A 复合物发挥作用。NSC697923 是一种细胞选择透过性Ubc13-Uev1A 复合物抑制剂，能抑制Ub-E2 硫酯键的形成，从而阻止Ub 向底物的转移[4]。

获能是精子成熟的重要步骤之一，最具代表性的变化是超激活运动。在获能期间，即精子与卵母细胞质膜融合之前，精子获得识别、结合并穿透透明带的能力[5-6]。目前对人类和哺乳动物精子的研究揭示了UPS 可能参与精子超激活运动和获能并由此调节精子与卵母细胞相互作用[7-11]，但UPS 调节精子获能的具体机制尚不清楚。因此本研究通过在猪精子获能液中添加E2 抑制剂NSC697923，探究精子蛋白泛素化水平对精子获能状态和精卵结合能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取延吉市某猪场年龄相似，健康无疾病的3 头种猪。

1.2 主要试剂 实验所用试剂无特殊说明均购自美国Sigma 公司，实验所用水均制自超纯水器（Milli-Q Academic A10），NSC697923 购自Selleckchem 公司，精子获能液（每1L 配6.61 g NaCl、0.223 g KCl、1.102 g CaCl2、1.98g葡萄糖、1.942 9 g咖啡因、0.55 g丙酮酸钠，2.42 g Tris、1g BSA、0.065 g 青霉素、0.05 g 链霉素），IVM 液（每1L 配15 g TCM-199l、0.549 6 g 葡萄糖、0.1 g丙酮酸、2.106 g NaHCO3、1 g 聚乙烯醇、0.075 g 青霉素、0.05 g 链霉素），TCM-washing 液（每1L IVM 液配6 g Hepes）和PBS-PVA 液（每1 L 配10g PBS 和1g PVA）。

1.3 实验方法

1.3.1 精液获取 从种猪场取回的新鲜精液在室温下平衡30 min，用PBS 调节精子密度为1×108个/mL。取出一部分进行常规检测（精子质量分析仪，购自圣普医疗设备有限公司），其中活力≥85%，精子畸形率≤20%，颜色呈浅灰或者乳白色，气味略带有腥味的样品方可进行后续实验。

1.3.2 精子获能 采用精子上浮法进行精子获能。取6个1.5 mL 无菌离心管，编号1～6，分别为空白对照组（未添加任何试剂）、阴性对照组（添加DMSO）和4 个NSC697923 处理组（5、10、15、20 μmol/L NSC697923），依次往6 个无菌离心管中加入经PBS 清洗后的精液1 mL，600 r/min 离心2～3 min，弃去上清液，向各组沉淀中依次加入1 mL 精子获能液，混匀，调整精子密度为1×108个/mL，除空白对照组外依次添加DMSO、不同浓度的E2 抑制剂NSC697923（5、10、15、20 μmol/L），将所有的离心管倾斜45°放入恒温培养箱（TC2323）中，38.5℃，5%的CO2浓度下孵育45～60 min。

1.3.3 诱导精子顶体反应（Acrosomal Reaction，AR）及考马斯亮蓝染色 分别将最终浓度为2 μmol/L 的钙离子载体（诱导组）和DMSO（未诱导组）加入到已获能的精子中，并在38.5℃、5% CO2和最大饱和湿度的培养箱中孵育30 min，后用考马斯亮蓝R250 避光染色30 min，流水冲洗甩干后，于光学显微镜下观察精子发生AR 的比例。

1.3.4 卵丘-卵母细胞复合体（Cumulus-Oocyte-Complex es，COCs）的获取及卵母细胞的体外成熟培养（In Vitro Maturation，IVM）挑选直径3～6 mm 卵泡用注射器（20 mL）吸取其内的卵泡液。将抽取到的卵泡液缓缓打入无菌的15 mL 离心管内，放入37℃水浴锅中。在收集所有卵泡液后，将离心管置于38.5℃培养箱中静置30 min，然后用巴士吸管吸出并弃上清，之后缓慢加入10 mL TCM-washing 液，轻轻混匀后放入38.5℃培养箱中静置10 min，取出，弃去上清液，缓慢加入8 mL TCM-washing 液，倒入90 mm 培养皿中，在附带38.5℃恒温板的显微镜下挑选3 层以上、卵丘细胞致密、胞质均匀的COCs。用捡卵针将若干COCs 依次用在38.5℃培养箱中预平衡2 h 以上的TCM-washing 液、PBSPVA 液和IVM 液清洗3～5 次，然后将所选的优质COCs放入IVM 成熟滴，25～30 个/小滴（IVM 液70 μL/小滴，覆盖矿物油，平衡2 h 以上），于38.5℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.3.5 卵母细胞的成熟判定 培养44 h 后进行 IVM 判定，在0.1%透明质酸酶中用1 mL 移液器轻轻反复吸吹COCs，在体式显微镜下挑选排出第一极体的M Ⅱ期成熟卵母细胞。

1.3.6 精子蛋白的提取 将各组精子悬浮液3 000 r/min离心3 min，弃上清，按1:100（v/v）的比例加入蛋白酶抑制剂PMSF 和裂解液RIPA 并混匀，用振荡器震荡3 min后，置于摇床40 min，12 000 r/min、4℃离心10 min，吸取上清，提取精子蛋白于-80℃冰箱中保存待用。

1.3.7 免疫印迹 用15%梯度凝胶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法分离各组的蛋白，PVDF 膜经TBST 最后清洗3 次后，添加一抗（兔抗Ub 抗体、小鼠抗GAPDH 抗体）在4℃下孵育14～18 h。再用TBST清洗3 次后，添加二抗（山羊抗兔IgG 过氧化物酶抗体、山羊抗小鼠IgG 过氧化物酶抗体）在室温下摇床上孵育2 h。用ECL 法处理PVDF 膜显现蛋白条带，固定拍照保存。通过ImageJ 软件对PVDF 膜条带进行灰度值分析。

1.3.8 精子黏附率检测 分别吸取20 μL 各组精液，注入到M Ⅱ期卵母细胞10 个/受精滴的90 mm 培养皿（依次按分组标记）中，进行精子-卵母细胞结合试验，然后置于38.5℃、5% CO2，最大饱和湿度培养箱中共孵育6 h，取出各组的卵母细胞用0.1% PVA-PBS 液洗涤3～5 次，然后用5%的戊二醛固定30 min，再用PVAPBS 液清洗3～5 次，最后用Hoechst 33342（碧云天生物技术研究公司）染色15 min，在荧光显微镜下对每个组的卵母细胞的附着精子数进行拍照并计数。

1.4 统计分析 使用Image J 软件对WB 条带灰度值和Hoechst 33342 荧光染色结果进行分析，所得数据使用SPSS 24 软件进行单因素方差分析，结果均表示为平均值±标准差，差异显著标准为P＜0.05。

2 结果

2.1 精子发生获能和顶体反应判定 精子经获能和顶体反应处理后，经考马斯亮蓝染色，已发生顶体反应的精子顶体未被染色，未发生顶体反应的精子顶体呈现蓝紫色（图1-A），钙离子载体诱导组的顶体反应率显著高于未诱导组（图1-B）。然后分别对鲜精、获能精子以及顶体反应精子进行免疫印迹分析，用p32 酪氨酸磷酸化一抗和酶标二抗孵育后，结果如图2-A 所示，分子量约为32 ku 处出现蛋白条带；分析蛋白条带的灰度值结果如图2-B 所示，获能精子和顶体反应精子的p32 酪氨酸磷酸化水平显著高于鲜精组。

2.2 获能对精子蛋白泛素化水平的影响 检测精子获能状态后，对鲜精、获能精子、顶体反应精子蛋白重新进行免疫印迹分析，结果如图3 所示，鲜精组在30 ku 处标记出Ub-蛋白条带，而获能和顶体反应组在30 ku 和46 ku 处均标记出Ub-蛋白条带；获能精子组和顶体反应组精子蛋白总泛素化水平显著高于鲜精组，表明精子获能或顶体反应时伴随着精子蛋白泛素化水平上调。

2.3 不同浓度E2 抑制剂对精子蛋白泛素化水平的影响如图4 所示，在30 ku 和46 ku 处均标记出Ub-蛋白条带，空白对照组和阴性对照组间精子蛋白泛素化水平差异不显著，NSC697923 处理组与对照组相比精子蛋白泛素化水平差异显著。

2.4 不同浓度E2 抑制剂对精子获能状态的影响 如图5所示，分子量约为32 ku 处仅有对照组出现蛋白条带，NSC697923 处理组与对照组相比没有精子蛋白磷酸化，表明获能液中添加E2 抑制剂未能真正引起获能。

2.5 不同浓度E2 抑制剂对精卵结合能力的影响 如图6所示，随着NSC697923 浓度的增加，蓝色荧光点数逐渐增加。使用 Lane1 软件进行分析，结果如图7 所示，添加NSC697923 处理组的精子黏附率显著低于对照组。

3 讨 论

Tardif 等[12]研究发现在猪精子获能期间，p32 的酪氨酸磷酸化含量增加。在此基础上，Kwon 等[13]提出p32 的磷酸化在调节精子获能方面起着关键作用，并可作为精子获能的生物标志物，这一观点目前已得到公认。本实验发现精子获能标志物的p32 酪氨酸磷酸化水平显著高于新鲜精液，表明精子得到有效获能。

由于UPS 在生物体的生理和病理过程中发挥了重要的作用，泛素化异常会导致疾病发生，特别是肿瘤的发生。因此，近年来研究人员已经开始逐渐将肿瘤的治疗靶点转向了UPS[4]，尤其是针对 E3、26S 蛋白酶体和DUB 而研发了新型的抗肿瘤药物。针对UPS进行的药物开发中，E2 抑制剂主要有两大类：一是从海绵动物中提取出的环状肽 Leucettamol A、化合物Manadosterols A 和B，都被证实能通过阻断 Ubc13 与UEV1A 的相互作用，从而抑制 Ubc13-UEV1A 复合体的形成，最终阻止K63 型多聚泛素链的形成，抑制底物降解。另有2 种Ubc13 抑制剂NSC697923 和BAY 11-7082，被证实可以通过在 Ubc13 活性位点半胱氨酸残基上，经过迈克尔加成反应形成共价加合物，分别抑制 DNA 损伤和 NF-κB 信号通路[14]。本研究中，NSC697923 处理组精子蛋白泛素化水平显著低于对照组，且有剂量依赖性，说明NSC697923 确实抑制了UPS，与Huang 等[15]的研究结果一致。

UPS 参与哺乳动物精子获能已得到证实[16]。Hillman 等[17]研究发现26S 蛋白酶体降解A 激酶锚定蛋白（AKAP 3），部分调节蛋白激酶A（PKA）的释放，这是通向获能所必需的步骤。此外，也有研究表明在精子获能时，可能会发生顶体内和顶体表面相关蛋白的从头泛素化和蛋白酶体降解相关靶蛋白，如精子黏附素（AQN1、AWN1）和顶体酶抑制剂（SPINK2）[11]、DQH 蛋白[16]、乳糖黏附蛋白（MFGE-8、P47）、去整合素和金属蛋白酶5（ADAM5）和顶体结合蛋白（ACRBP）[10,18]等。本实验中，在精子获能和顶体反应后的蛋白泛素化水平明显上调的情况下，向获能液中添加E2 抑制剂NSC697923 抑制UPS 后，检测精子蛋白p32 酪氨酸磷酸化水平，发现仅有对照组在32 ku 处出现蛋白条带，表明添加NSC697923 后UPS 途径得到抑制的精子均未获能。以上结果表明，获能确实伴随着精子蛋白泛素化水平上调，说明UPS 参与了精子的获能过程，且必不可少，这与Zigo 等[16]的研究结果相符。

UPS 在哺乳动物精子发生和体外受精过程中都具有重要的作用[16,19]。在UPS 参与精子获能的证据方面，目前研究最多的是26S 蛋白酶体。添加蛋白酶体抑制剂如MG-132 和环氧霉素可抑制顶体外膜重塑，改变获能，防止发生顶体反应，显著降低体外受精能力[19-20]。此外，还有E1 抑制剂PyR-41 在获能过程中也改变顶体外膜重构，降低获能能力，在体外受精中防止精子穿透透明带，降低精子体外受精卵母细胞的能力[11]。目前已鉴定出更多的精子蛋白酶体/UPS 底物，并揭示了UPS 调节的性质[5]。但还没有关于这些蛋白质在获能过程中是如何被UPS 调控的确切证据。本研究中，NSC697923处理组的精卵结合能力显著低于对照组，且随着E2 抑制剂浓度下降，黏附率也随之下降。说明抑制精子UPS会降低精子体外受精的精卵结合能力。

4 结 论

本研究结果表明，猪获能精子的蛋白泛素化水平显著上调，而在猪精子获能液中添加E2 抑制剂NSC697923 则能显著抑制精子获能，且随着抑制剂浓度的增加，精子黏附率显著下降，说明UPS 是猪精子获能必不可少的环节。本研究支持了UPS 在精子获能中有重要作用这一前人的研究结果，进而提出了将精子蛋白泛素化水平作为检测精子获能指标的可能性，但精子蛋白质泛素化水平能否作为精子获能的标志还有待于进一步研究。