miR-10b 对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响

郭乐薇 ,赵 静 ,刘红羽 ,王 军* ,吕文发*

（1.吉林农业大学现代农业技术教育部国际合作联合重点实验室，吉林长春 130118；2.吉林农业大学动物生产与产品质量安全教育部重点实验室,吉林长春 130118）

卵巢作为雌性动物的重要繁殖器官，卵子生成和排卵以及性腺激素合成分泌均影响动物的繁殖性能[1-2]。卵泡是卵巢的基本功能单位[3]，每个卵泡均由颗粒细胞包围一个卵母细胞组成。作为卵巢中必需的体细胞，颗粒细胞在机体内环境下以增殖和凋亡的形式共同存在。颗粒细胞的增殖分化会促进卵泡发育、配子发生等生理过程[4-5]；而其凋亡是卵泡闭锁的主要原因[6]。

MicroRNA（miRNA）是长度为20～25 个核苷酸的非编码RNA，其通过靶向mRNA 3 ´UTR 内的部分互补序列起作用，降解或抑制其翻译。miRNA 通过调节细胞增殖、分化和凋亡等多种细胞过程在生理和病理条件下发挥作用[7-8]。miRNA 参与卵巢卵泡发育的整个过程，包括卵泡生长、闭锁和排卵[9]。miR-10 家族位于HOX基因簇内，包括miR-10a 和miR-10b[10]。HOX 不仅可维持正常组织的增殖与分化过程，而且其突变会引起雌性生殖道和子宫发育异常，导致不孕[11]。miR-10 家族在早期胚胎发育期间与HOX 共表达[12]，推测miR-10b在胚胎发育中发挥重要作用。魏金销等[13]研究发现，miR-10b 可抑制山羊卵巢颗粒细胞的活性。然而目前关于miR-10b 对牛卵巢颗粒细胞的影响尚不清楚。本研究旨在通过Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）、Western Blot 和流式细胞术探究miR-10b 对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响，为减少母畜卵泡资源浪费、提高母畜繁殖能力提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 DMEM/F12（Gibco，美国）；双抗（生工生物工程有限公司，中国）LipofectamineTM2000（赛默飞世尔科技公司，中国）；miR-10b 模拟物（mimics）和mimic NC（苏州吉玛基因股份有限公司，中国）；总RNA 提取试剂Trizol、反转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒（TaKaRa，日本）；RIPA 裂解液、SDSPAGE 凝胶快速配制试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术公司，中国）；Intercept®（PBS）Blocking Buffer（LI-COR，美国）；超敏ECL 化学发光试剂盒（新赛美生物科技有限公司，中国）；细胞凋亡试剂盒（BD Pharmingen，美国）。

1.2 牛卵巢采集和卵巢颗粒细胞培养 本实验所用卵巢均从屠宰场刚屠宰的母牛身上取出，新鲜卵巢组织浸润在37℃含双抗（链霉素和青霉素的混合液）的生理盐水中，并在3 h 内运回实验室。手术剪剪去卵巢周围多余组织，使用37℃含双抗的生理盐水冲洗2 次，75%酒精浸泡30 s，再用37℃含双抗的生理盐水冲洗3～5 次。移入无菌操作台，使用5 mL 注射器抽吸3～6 mm 的健康卵泡。卵泡液经1 000 r/min 离心5 min，细胞沉淀用37℃含双抗的DMEM/F12 重悬细胞，重复2～3 次。细胞计数后以1×106～1.2×106的密度接种，转移至37℃，5%CO2的培养箱中，24 h 后弃细胞上清液，换新鲜培养液继续培养，并根据后续实验需求，进行相应处理。

1.3 牛卵巢颗粒细胞转染 在转染前1 d，将细胞接种至60 mm 板中（1×106个/孔），加入含有10%胎牛血清的培养液，保证其在第2 天细胞密度达到70%～90%。分别使用1 250 μL DMEM/F12稀释500 pmol miR-10b mimics和mimics NC 并混匀，序列见表1。1 000 μL DMEM/F12稀释20 μL LipofectamineTM2 000，混匀并室温静置5 min。将前两步的预混液混合，室温孵育20 min。用PBS 冲洗细胞3 次，每板加入混合液并加入DMEM/F12 补充至4.5 mL，轻晃混匀，37℃，5% CO2培养箱培养。6 h 后每板加入500 μL 胎牛血清，继续培养至48 h，提取RNA 和蛋白用于后续检测。

表1 miR-10b mimics/NC 序列

1.4 RNA 提取和qRT-PCR TRIzol 法提取牛卵巢颗粒细胞总RNA 并反转录为cDNA，用于qRT-PCR 检测。本实验所需的引物由上海生工生物工程有限公司合成（表2）。qRT-PCR 反应体系20 μL：2 μL cDNA 模板，10 μL SYBR Premix Ex Taq II，0.4 μL ROX reference Dye II，上游、下游引物各0.8 μL（0.4 μmol/L），6 μL ddH2O。反应程序：95℃ 30 s；40×（95℃ 5 s，56～64℃34 s）；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95°C 15 s。用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量，每个样本进行3 次重复分析。

1.5 蛋白提取和Western Blot RIPA 裂解液提取牛卵巢颗粒细胞的总蛋白，根据BCA 说明书检测处理样品蛋白浓度。配制12%聚丙烯酰胺凝胶，上样40 μg/孔。80 V 电压电泳至分离胶，更换电压为160 V，采用半干转法转膜，0.12 A 28 min。使用Intercept®（PBS)Blocking Buffer 封闭1.5 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤5 min/5 次，二抗孵育1 h，TBST 洗涤5 min/5 次，随后用ECL 发光液显影,用Tanon Gis 软件进行灰度值分析。抗体信息见表3。

表2 qRT-PCR 引物序列

表3 Western Blot 抗体信息

1.6 流式细胞术 将处理好的细胞弃液，PBS 冲洗3遍，胰酶消化，1 000 r/min 离心5 min，弃上清。再用PBS 重悬细胞1 000 r/min 离心5 min，重复2 次。根据细胞凋亡试剂盒要求，加入200 μL 1×Buffer，PI 和FITC 各5 μL，37℃培养箱孵育20 min，再加入100 μL 1×Buffer。过膜至流式管中，立即上机检测。

1.7 统计分析 使用GraphPad prism 5.0 对数据进行t检验，数据用平均值±标准差表示，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-10b 转染验证 qRT-PCR 检测内源miR-10b的表达，验证miR-10b 的转染效率。如图1 所示，与mimics NC 组比较，miR-10b mimics 组中miR-10b 表达量极显著升高，表明miR-10b mimics 转染成功。

2.2 qRT-PCR 检测凋亡相关基因 如图2 所示，与mimics NC 组相比，miR-10b mimics 组Bax（P＜0.01）和Caspase-3（P＜0.05）mRNA 表达水平升高，Bcl-2mRNA 表达水平降低（P＜0.05）。表明miR-10b 可影响凋亡相关基因的表达，促进牛卵巢颗粒细胞凋亡。

2.3 Western Blot 检测凋亡相关蛋白 如图3 所示，与mimics NC 组相比，miR-10b mimics 组Bax（P＜0.01）和Caspase-3（P＜0.05）蛋白表达水平升高，Bcl-2 蛋白表达水平显著极降低。与qRT-PCR 结果一致，表明miR-10b 可影响凋亡相关蛋白的表达，促进牛卵巢颗粒细胞凋亡。

2.4 细胞凋亡水平检测 如图4 所示，与mimics NC 组相比，miR-10b mimics 组细胞凋亡率升高（P＜0.01）。

3 讨论

在卵泡发育过程中，卵母细胞和周围颗粒细胞之间的相互作用对于正常的卵泡发育和卵母细胞成熟至关重要[14]。因此，卵巢颗粒细胞的凋亡会影响母畜的繁殖性能。miRNA 可调节许多细胞过程，如细胞增殖、凋亡和分化。近年来，越来越多的研究表明miRNA 在颗粒细胞功能的调节中起着关键作用。体内卵巢氧化应激模型中miR-181a 通过下调SIRT1 使FoxO1 乙酰化，进而促进鼠颗粒细胞凋亡，损害其卵泡发育；而敲除内源性miR-181a 则阻止了H2O2诱导的颗粒细胞凋亡[15]。miR-1275 是在猪卵巢卵泡闭锁过程中差异表达的miRNA 之一。研究发现miR-1275 可抑制雌二醇（E2）释放和CYP19A1 的表达，以促进猪颗粒细胞的早期凋亡，引发猪卵巢卵泡闭锁[16]。Wang 等[17]研究表明，信号转导和转录激活因子3（STAT3）参与卵泡生长，用miR-125a-5p mimics 转染小鼠颗粒细胞观察到STAT3 表达降低，Cleaved-caspase3 蛋白表达升高，颗粒细胞凋亡。本研究发现miR-10b 可促进牛卵巢颗粒细胞凋亡，影响凋亡相关因子表达。

miR-10 家族在不同物种之间高度保守。Tu 等[18]研究发现miR-10b 可通过抑制TGF-β途径抑制人、小鼠和大鼠颗粒细胞增殖并诱导其凋亡。CYP19A1 编码芳香酶，是E2合成中的关键酶，在猪卵泡闭锁过程中被下调。Li 等[19]研究发现miR-10b 可通过靶向CYP19A1 抑制E2释放参与猪卵巢颗粒细胞凋亡。脑源性神经营养因子（BDNF）及其高亲和力受体酪氨酸激酶受体B 被认为与雌性生殖有关。最近已证明在卵泡活化和卵母细胞成熟中起着重要作用。Peng 等[20]使用双荧光素酶报告基因测定法将BDNF基因鉴定为miR-10b 的直接靶标，证明了miR-10b 可通过直接靶向BDNF 抑制山羊颗粒细胞增殖。然而，关于miR-10b 对牛卵巢颗粒细胞的作用尚不清楚。许多凋亡信号因子（Bax、Bcl-2 和Caspase-3等）在颗粒细胞中发挥作用。Bax 可通过破坏线粒体内外膜完整性来对抗抗凋亡基因[21]，与健康卵泡相比，闭锁卵泡颗粒细胞中Bax 的表达更高[22]。Bcl-2 可定位至线粒体内外膜上发挥作用对抗凋亡[23]，Bcl-2 过表达可减少有腔卵泡的颗粒细胞凋亡，促进卵泡发生[24]。Caspase-3 是引起细胞凋亡的起始因子[25]，能够诱导细胞发生不可逆转的凋亡，Caspase-3基因敲除小鼠表现出颗粒细胞凋亡数量显著降低[26]。本研究将miR-10b mimics 转染牛卵巢颗粒细胞，发现miR-10b 可促进牛卵巢颗粒细胞的凋亡且伴随着Bcl-2 mRNA 和蛋白表达降低，Bax 和Caspase-3 mRNA 和蛋白表达升高。本研究结果与以往报道一致，表明miR-10b 在不同物种中的颗粒细胞中具有相似的功能且高度保守。尽管本研究已证明miR-10b 可促进牛卵巢颗粒细胞凋亡，但其作用机制尚不清楚，需进一步研究。

4 结 论

本研究结果表明，miR-10b 可促进牛卵巢颗粒细胞凋亡，显著降低Bcl-2 mRNA 和蛋白表达水平，显著升高Bax、Caspase-3 mRNA 和蛋白表达水平。