超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中头孢拉定残留

金晓峰, 焦仁刚, 赵 贵*, 栾庆祥, 黄 鑫, 章厉劼,王庆红, 孙真峥, 黄 瑾, 周光华, 雷学昌

(1.贵州省兽药饲料监察所,贵州贵阳 550003；2.黔西南州畜牧水产品质量安全检测站，贵州兴义 562400；3.黔南州农产品质量安全监督综合检测中心，贵州都匀 558013)

头孢拉定(Cephradine)别名为先锋霉素Ⅵ、头孢菌素Ⅵ等，它是第一代半合成头孢菌素，为白色或类白色结晶性粉末，分子式为C16H19N3O4S。头孢拉定对耐药性金葡菌及其它多种对广谱抗生素耐药的杆菌等有迅速而可靠的杀菌作用，它也是人用抗生素。根据我国《兽药管理条例》第四十一条，禁止将人用药物用于动物，但在养殖产业中为追求治疗效果，违规使用头孢拉定的情况较为普遍。因此，“人药兽用”带来的药物残留直接威胁了人们的健康[1]，也对生态环境、食品安全等带来了一定危害[2，3]，我国已将兽用抗菌药物列为主要监管对象[4，5]。

目前，我国已制定的头孢类兽药残留标准包括了头孢匹林、头孢噻呋、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟、头孢唑啉共6种，但头孢拉定残留检测还没有标准方法。已报道的头孢拉定检测方法主要为酶联免疫法[6]、液相色谱法[7，8]、荧光分光光度法[9]、微生物法[10]、光化学极谱法[11]、流动注射化学发光法[12，13]、紫外分光光度法[14，15]、液-质联用法[16，17]。液-质联用法具有高通量、高灵敏度、高准确度、实验周期相对较短的优点，是目前兽药残留检测的主要手段。已报道液-质联用检测法中，范莹莹建立了猪肉经匀浆提取、正己烷液液萃取脱脂、XAD -2固相萃取柱净化，液-质联用仪测定头孢拉定残留量的方法[16]；贾涛建立了牛奶经涡旋提取、正己烷液液萃取脱脂、C18固相萃取柱净化，液-质联用仪测定头孢拉定残留量的方法[17]。此两种方法均需4步操作，且固相萃取需预洗、上样、淋洗、洗脱步骤，操作较为繁琐。本文建立了只需涡旋提取、固相萃取直接净化共2步前处理的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)联用检测方法，经验证，其准确度、精密度、灵敏度均符合标准(NY/T 1896-2010)《兽药残留实验室质量控制规范》中兽药残留检测方法性能要求，与传统方法相比，本文方法降低了有机试剂的消耗，提高了实验效率，为鸡肉中头孢拉定残留量的快速测定提供新的依据，对于强化鸡肉兽药残留监控、推动家禽产品质量安全监管具有重要意义。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

Waters XEVO TQ-XS超高效液相色谱-串联质谱仪(美国，沃特世公司)，配电喷雾离子源，Masslynx软件；Mettler AB104-S天平(瑞士，梅特勒公司)；IKA Minisharker涡旋振荡器(德国，伊卡公司)；SIGMA 3K15高速冷冻离心机(德国，西格玛公司)；Waters PRiME HLB型固相萃取柱(规格为60 mg/3mL，美国沃特世公司)。

头孢拉定对照品(中国食品药品检定研究院，含量88.4%，批号：130427-201708)。标准储备溶液：精密称定10 mg头孢拉定对照品，置于100 mL容量瓶中，乙腈溶解并定容，得到含头孢拉定100 μg/mL的标准储备溶液，-20 ℃保存。标准中间溶液：精密移取100 μL头孢拉定标准储备溶液，置于100 mL容量瓶中，0.2%甲酸水溶液定容，得到含头孢拉定100 ng/mL的标准中间溶液，4 ℃保存。标准工作溶液：为消除基质效应，本方法采用基质加标制备标准曲线，分别精密移取适量的头孢拉定标准中间溶液，加入到0.5 mL净化后的空白试样中，0.2%甲酸水溶液定容至1.00 mL，绘制浓度为0.5、1、5、10、20、50 ng/mL的标准工作曲线。甲酸(色谱纯，德国默克公司)；乙腈(质谱级，德国费舍尔公司)。实验用水均为Milli-Q Direct-Q 10超纯水。

1.2 样品制备

鸡肉样品购自农贸市场。将样品绞碎并均质，于-20 ℃冷冻保存，用前室温下解冻。称取鸡肉样品2±0.05 g，置于50 mL离心管中，准确加入80%乙腈水溶液8.00 mL，涡旋提取2 min，于5 ℃下10 000 r/min离心10 min，上清液转移至玻璃试管中，备用。取上清液2 mL直接过PRIME HLB柱，收集滤过液，准确吸取0.50 mL滤过液，加入0.2%甲酸水溶液0.50 mL，使总体积为1.00 mL，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜后，待测。

1.3 液相色谱-质谱条件

液相色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流动相为0.1%甲酸(A)和0.1%甲酸乙腈(B)，梯度洗脱程序为：5%B(0.00～0.50 min)，5%～95%B(0.50～18.00 min)，95%B(18.00～19.00 min)，95%～5%B(19.00～19.01 min)，5%B(19.01～20.00 min)；流速为0.4 mL/min，柱温为30 ℃，进样体积为2 μL。

质谱条件：电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；监测方式：多反应监测(MRM)；电离电压：3.0 kV；源温：150 ℃；雾化温度：650 ℃；锥孔气流速：150 L/h；雾化气流速：1 000 L/h；定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量如表1所示。

表1 头孢拉定的MS/MS采集参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

头孢拉定是硫氮杂环化合物，易加合1个H+，形成(M+H)+分子离子，故离子源选择了电喷雾正离子(ESI+)模式。向超高效液相色谱-串联质谱仪中，以10 μL/min注入100 ng/mL头孢拉定标准溶液，调谐优化MS/MS条件，以一级质谱调谐优化电离电压、雾化温度、雾化气流速和锥孔电压，确定分子离子质荷比。再经二级质谱调谐，对子离子碎片进行分析，选取丰度比强度最大的2个子离子，优化碰撞能量，确定子离子质荷比。母离子与2个子离子共同形成2对多反应监测离子对作为定性离子对，并以信号响应强者为定量离子对(表1)。

2.2 色谱条件的选择

头孢拉定为弱极性化合物，适合反相色谱系统分析。对比了ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)两种反相色谱柱，均能获得良好的峰形，但HSS T3柱的保留能力更强，峰形更对称尖锐，因此选择该色谱柱进行分析。标准溶液、空白鸡肉样品及阳性添加样品的多反应监测(MRM)色谱图见图1～3。

图1 0.5 ng/mL头孢拉定标准溶液多反应监测色谱图Fig.1 Multi-reaction monitoring chromatograms of 0.5 ng/mL cephradine standard solution

图2 空白鸡肉样品多反应检测色谱图Fig.2 Multi-reaction monitoring chromatograms of blank chicken sample

图3 1.0 μg/kg添加水平鸡肉样品多反应检测色谱Fig.3 Multi-reaction monitoring chromatograms of 1.0 μg/kg chicken sample

2.3 稀释倍数对基质效应和灵敏度的影响

样品制备时，试验了1倍稀释(0.50 mL过柱滤液定容至1.00 mL)，及5倍稀释(0.20 mL柱滤液定容至1.00 mL)两种稀释方式。经超高效液相色谱-串联质谱仪按上述仪器条件测定，以基质标样响应值与溶剂标样响应值的百分比值衡量基质效应，1倍稀释时基质标样350.1>176.0和350.1>158.0离子对基质效应分别为79.2%和87.5%，存在基质抑制情况；5倍稀释时，两个离子对基质效应分别为97.0%和100%，没有明显基质效应。但5倍稀释与1倍稀释相比，灵敏度也降低了5倍。根据标准(NY/T 1896-2010)《兽药残留实验室质量控制规范》，禁用药物检测方法的定量限应尽可能低，一般至少低于或者等于1 μg/kg。因此最终选择1倍稀释、基质标样外标法定量，作为测定头孢拉定残留量的实验条件。

2.4 提取溶剂的选择

头孢拉定常用的提取溶剂有乙腈∶水(15∶2，V/V)[8]、0.5%乙酸水溶液[16]、乙腈[17]。本文考察了0.5%乙酸水溶液、80%乙腈溶液、乙腈3种溶剂的提取效果，80%乙腈溶液回收率最高，实验中纯乙腈还引起了鸡肉样品表面蛋白质变性，影响了涡旋效果。最终选择了80%乙腈作为提取液。

2.5 固相萃取柱的选择

已报道的头孢拉定固相萃取主要采用XAD -2固相萃取柱[16]和C18固相萃取柱[17]，净化过程需经过预洗、上样、淋洗、洗脱共4个步骤，操作时间长，消耗有机试剂多，对实验人员健康及环境安全有一定影响。本文采用了新型PRiME HLB固相萃取柱，只需上样一个步骤，且不需要消耗预洗、淋洗、洗脱过程产生的有机溶剂，简化了操作，提高了效率。

2.6 线性范围

基质匹配系列标准溶液按峰面积以外标法进行回归计算，绘制得到的标准曲线在0.5～50.0 ng/mL范围内呈良好线性，曲线方程为：Y=3 308.8X-100.61，相关系数R2为0.9998。

2.7 灵敏度考察

向空白鸡肉样品中添加适量头孢拉定，经上述方法测试，观察特征离子色谱峰信噪比(S/N)和对应药物的浓度，当样品中头孢拉定含量为0.5 μg/kg时，液-质谱图峰S/N>3，即检测限为0.5 μg/kg；当样品头孢拉定含量为1 μg/kg时，液质-谱图峰S/N>10，即定量限为1 μg/kg。

2.8 准确度和精密度

向空白鸡肉样品中添加适量头孢拉定，制备得到头孢拉定含量分别为1.00、2.00、10.0 μg/kg的阳性添加样品，3个浓度添加水平均进行6次平行实验，考察方法的准确度；同时计算相对标准偏差(RSD)，以批内和批间实验结果的RSD考察方法的精密度。实验结果如表3所示。

表3 准确度及精密度实验结果(n=6)

各组实验中，头孢拉定回收率最低为77.3%(2.00 μg/kg添加水平)，最高为106.8%(1.00 μg/kg添加水平)，因此回收率范围在77.3%～106.8%之间，符合标准(NY/T 1896-2010)《兽药残留实验室质量控制规范》中兽药残留检测方法准确度的要求。

从鸡肉样品中各浓度头孢拉定含量测定结果的相对标准偏差分析实验精密度，批内RSD为3.2%～10.5%，3 d重复实验批间RSD为1.3%～5.7%，符合(NY/T 1896-2010)《兽药残留实验室质量控制规范》中兽药残留检测方法精密度的要求。

2.9 样品检测

取市售13批鸡肉，按上述方法制备样品，上机测定，均未检出头孢拉定。

3 讨论

本文研究了鸡肉中头孢拉定药物残留的提取方法和净化方法，以及色谱、质谱条件对实验结果的影响，建立了采用80%乙腈溶液提取鸡蛋样品中的头孢拉定，PRiME HLB固相萃取净化，超高效液相色谱-串联质谱法测定头孢拉定残留量的方法。经实验，确定了方法的线性范围、灵敏度，同时验证了准确度、精密度，符合标准(NY/T 1896-2010)《兽药残留实验室质量控制规范》中兽药残留检测方法性能标准要求。