石墨烯-管尖固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定贝类中3种原多甲藻酸贝类毒素

万译文，杨 霄*，黄向荣，索纹纹，何 咏，曾春芳

(1.湖南省水产科学研究所，湖南长沙 410153；2.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南常德 415000；3.农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙)，湖南长沙 410153)

原多甲藻酸(Azaspiracids，AZAs)贝类毒素于1995年发现自爱尔兰的紫贻贝(Mytilusedulis)中，它们是一类脂溶性聚醚生物毒素[1]，具有一个独特的螺旋环和一个脂肪族羧酸基，属氨代螺旋酸类贝类毒素。目前共发现32种AZAs的同系物，已确定化学结构的有11种，其中最常见且毒性最大的分别为AZA1、AZA2及AZA3 3种[2，3]。AZAs贝类毒素比较稳定，在酸性、碱性和高温条件都不能使其毒性降低，人食用含有AZAs贝类毒素后会发生胃肠道紊乱，主要的中毒症状有恶心、呕吐、腹泻、胃痉挛等。2002年，欧盟规定双壳类水产品中AZA1，AZA2和AZA3的最大允许浓度为160 μg/kg(以贝肉计)[4]。

目前，AZAs贝类毒素的检测方法主要有生物测试法和高效液相色谱-串联质谱法。生物测试法只能测定毒素总量，灵敏度和准确度均欠佳，可能产生假阳性结果而导致无法对其准确定性定量[5]。高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)具有灵敏度高、特异性强的特点，因此，人们开始重点研究建立分析AZAs贝类毒素的液相色谱-质谱分析方法，并对AZAs贝类毒素的分布地域和范围进行调查研究[6 - 8]。贝类产品基质较为复杂，目前已报道的AZAs贝类毒素的样品前处理方法多为C18和功能性聚合物吸附剂填充的固相萃取柱[9，10]或基质分散固相萃取技术[11 - 14]。管尖固相萃取(Pipette Tip Solid-phase Extraction，PT-SPE)是一种新型的小型化固相萃取技术，相较于传统的固相萃取，其具有萃取装置制作简单、成本低，吸附剂选择范围宽，萃取吸附剂和溶剂用量少，萃取效率高等优点，近年来在复杂基质样品前处理中引起了学者们的广泛关注[15-17]。

石墨烯(Graphene)是一种新型二维平面碳纳米材料，由于其具有大的比表面积、大的共轭体系、很强的疏水性和化学稳定性等特点，得到广泛应用[18-20]。近年来，一些研究者将石墨烯吸附剂与管尖固相萃取技术的特点相结合，设计制作了简单、高效的小型化固相萃取装置，并成功应用于贝类产品[15]、牛奶[16]、豆芽[21]、果汁[22]、人血浆[23]、减肥补充剂[23]等复杂基质样品中目标化合物的分析检测。本实验将石墨烯和管尖固相萃取(G -PT-SPE)技术相结合，应用于贝类样品前处理的净化过程，结合HPLC-MS/MS技术，建立了一种简单、快速测定贝类中3种AZAs贝类毒素的分析方法，并成功应用于实际贝类样品的分离检测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

TSQ Quantum Access高效液相色谱-串联质谱仪(美国，Thermo Fisher Scientific公司)；氮吹仪(美国，Organomation公司)；高速冷冻离心机(日本，日立公司)；漩涡振荡器(美国，Fisher公司)；超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；中沃超纯水仪(中沃水务环保科技有限公司)。

AZA1(CRM-AZA1-b,1.30±0.07 μg/mL)、AZA2(CRM-AZA2-b,1.22±0.06 μg/mL)、AZA3(CRM-AZA3,1.04±0.04 μg/mL)标准溶液均购自加拿大海洋生物科学研究所(NRC)；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷(色谱纯，德国Merck公司)；二氯甲烷(色谱纯，天津市科密欧试剂有限公司)；甲酸(色谱-质谱纯，美国Sigma公司)；石墨烯(厚度:～1 nm，片径:1～100 μm)购自南京吉仓纳米科技有限公司。实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

贝类样品主要包括僧帽牡蛎(Saccostreacucullata)、紫贻贝(Mytilusedulis)和毛蚶(Scapharcasubcrenata)，于2017年6月到9月采自福建省福州、漳州、厦门的贝类养殖户和水产品市场。贝类样品运至实验室后用水洗净，开壳取其贝肉，沥干水分，匀浆，于-18 ℃冷冻保存。

1.2 标准溶液的配制

准确移取适量的3种贝类毒素标准品溶液，用甲醇配制成质量浓度均为0.125 mg/L的AZA1、AZA2和AZA3混合标准溶液。

1.3 样品处理

1.3.1 提取称取2.0 g(±0.02 g)样品于50 mL离心管中，加入9 mL甲醇，涡旋振荡1 min，超声提取5 min，8 000 r/min离心5 min，将上清液转移至20 mL玻璃管中。重复上述操作，合并上清液，用甲醇定容至20 mL。吸取上述提取液5 mL至玻璃管中，于40～50 ℃下氮吹至约0.5 mL，用 2 mL正己烷脱脂两次，弃去正己烷层。加入2 mL乙酸乙酯后，旋涡1 min进行萃取，以6 000 r/min 离心 5 min，重复上述操作，合并乙酸乙酯层后，于40～50 ℃用氮气吹干。加入150 μL的甲醇溶解残渣，再加入850 μL的水，涡旋混匀1 min，10 000 r/min离心5 min，待净化。

1.3.2 G -PT-SPE装置组装及净化过程实验室自制的G -PT-SPE装置组装过程如下[25]：取200 μL、1 mL移液枪头各一个，用甲醇和水洗涤干净后于室温下晾干。然后根据200 μL移液枪头的形状特点在枪头末端一固定的位置填充适量的脱脂棉，称取1.0 mg石墨烯粉末填装到200 μL枪头中，再往枪头石墨烯层上端填充适量的脱脂棉。然后根据1 mL移液枪头的形状特点在枪头下端一固定位置切去一段，并将其插入到上述200 μL枪头上端。组装好的G -PT-SPE装置中石墨烯材料在管尖处的装填高度约为1 cm。净化过程如下：依次用1 mL甲醇和1 mL水预处理小柱，然后加入提取液，再用1 mL 10%的甲醇水溶液淋洗，最后用1 mL 1%的氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，滤液供HPLC-MS/MS法测定。

1.4 空白基质标准曲线的绘制

取空白基质样品，按1.3节的样品前处理方法制备空白基质溶液，添加适量1.2节中配制的混合标准溶液，配制成AZA1、AZA2和AZA3的浓度均为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/kg的基质标准系列工作溶液，并分别上机测定。以被测组分的峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x,μg/kg)为横坐标，绘制空白基质标准曲线。

1.5 色谱-质谱条件

色谱条件:Kinetex XB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)；流动相A为超纯水(含2 mmol/L甲酸铵，50 mmol/L甲酸)；流动相B为95%乙腈溶液(含2 mmol/L甲酸铵，50 mmol/L甲酸)；梯度洗脱程序：0～7.0 min,20%～90%B;7.0～10.0 min,90%B；10.0～12.0 min,20%B。流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，选择反应监测(SRM)模式；喷雾电压3 500 V；离子传输毛细管温度350 ℃；蒸发温度300 ℃；鞘气压力为276 kPa，辅助气压力为69 kPa，碰撞气压力199.983 mPa。优化后的其它质谱采集参数见表1。

表1 3种原多甲藻酸贝类毒素的质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择和优化

采用流动注射进样方式，以10 μL/min的流速，将1.2节配制的混合标准溶液注入离子源中。在正离子模式下对AZAs进行一级质谱扫描，获得目标物的分子离子峰[M+H]+，以各化合物的[M+H]+为母离子，优化喷雾电压、鞘气压力、辅助气压力、离子传输毛细管温度等参数。然后利用二级质谱全扫描收集各组分母离子对应的的子离子信息，分别从中选取相对丰度最强和次强的子离子作为各自的定量离子和定性离子，并优化碰撞能。最终确定1.5节所述的质谱条件。

2.2 色谱条件的确定

色谱条件参见文献报道[9，10]。选用Kinetex XB-C18色谱柱对AZAs贝类毒素进行分离，以含有50 mmol/L甲酸、2 mmol/L 甲酸铵的水溶液和乙腈-水(95∶5，V/V)溶液作为流动相，梯度洗脱。结果表明，3种AZAs贝类毒素均具有较高的灵敏度和选择性，且峰形尖锐，3种AZAs贝类毒素的SRM色谱图见图1。

图1 3种原多甲藻酸贝类毒素的选择反应监测(SRM)色谱图Fig.1 SRM chromatograms of three AZAs

2.3 提取条件的选择

用于提取贝类产品目标组分的溶剂有甲醇、80%甲醇水溶液、90%甲醇水溶液、二氯甲烷等[9，26]。本实验通过在空白牡蛎中添加同一水平的贝类毒素后，分别对甲醇、80%甲醇水溶液、90%甲醇水溶液、二氯甲烷四种提取剂的提取效果进行考察。结果表明，二氯甲烷的提取液很浑浊且有悬浮物，不利于进一步净化。甲醇具有较强的提取AZAs的能力，但得到的提取液含大量杂质，对随后的富集净化带来挑战，且对目标物离子碎片丰度产生一定影响。采用80%和90%甲醇水溶液作提取剂时，两者对AZA1、AZA2、AZA3的提取率均较高，回收率在85%以上，可以满足3种目标毒素同时检测要求，且提取液中含有的杂质较少，有利于进一步的净化。考虑到90%甲醇水溶液的挥发速率大于80%甲醇水溶液，氮吹时较易浓缩，故本实验选用90%甲醇水溶液为提取溶剂。

2.4 净化条件的选择

贝类样品基质复杂，贝肉中含有大量的蛋白质、脂肪、色素等物质，故需要对粗提液做进一步净化处理。贝类样品经90%甲醇水溶液沉淀蛋白后，高速离心去除大部分的蛋白质，提取液氮吹后再经正己烷萃取2次，可有效去除大部分脂肪，有利于后续净化过程。

在液-液萃取实验中，分别以二氯甲烷和乙酸乙酯为萃取剂，发现两种溶剂均可将毒素从甲醇水溶液中萃取出来，同时能去除部分脂肪和色素。考虑到乙酸乙酯的毒性更小，本研究选择乙酸乙酯为萃取剂。

为了考察G -PT-SPE的净化效果，采用样品提取液过柱和不过柱相比较的结果进行评价，具体评价方法为：取两份空白试样，添加同一水平的贝类毒素(5.0 μg/kg)后，一份按1.3.1的方法处理后上机分析，另一份按1.3.1和1.3.2的方法处理后上机分析。实验结果表明：提取液经G -PT-SPE净化后，溶液颜色较浅，且各目标物色谱峰面积比未过柱样品大约11%～15%。这说明提取液经G -PT-SPE进一步净化后可以去除部分色素和其他可能的干扰物质(如中小分子杂质等)，从而降低了基质对毒素的抑制效应。

2.5 G -PT-SPE条件的优化

为了获得较高的萃取回收率，实验对影响G -PT-SPE的条件(石墨烯的用量、淋洗剂的种类和用量、洗脱剂的种类和用量)进行了优化。

2.5.1 石墨烯的用量考察了不同用量的石墨烯对3种毒素的萃取回收率的影响。结果如图2所示，当石墨烯的用量从0.5 mg增加到1.0 mg时，各组分回收率都有明显增大；继续增加石墨烯的用量，各组分回收率无明显变化。因此，选择1.0 mg石墨烯作为最佳的吸附剂用量。

图2 石墨烯用量对3种原多甲藻酸贝类毒素回收率的影响(n=3)Fig.2 Effect of amount of graphene on the recoveries of three AZAs(n=3)

2.5.2 淋洗剂的种类和用量固相萃取的淋洗步骤可以有效地去除样品粗提液中共吸附的干扰杂质。本实验考察了不同种类淋洗剂对目标物回收率的影响。实验中选取甲醇、甲醇-水溶液(1∶1，V/V)、甲醇-水溶液(1∶4，V/V)、甲醇-水溶液(1∶9，V/V)以及水作为淋洗剂，考察其对目标组分的提取回收率的影响。实验结果表明，甲醇和甲醇-水溶液(1∶1，V/V)作为淋洗剂会造成所有目标组分很大程度的损失，回收率仅为5%～30%，甲醇-水溶液(1∶4，V/V)作为淋洗剂时各目标组分都有一定程度的损失，回收率为74%～82%，而甲醇-水溶液(1∶9，V/V)和水作为淋洗剂所有目标物均可获得较高的回收率，回收率为85%～95%。考虑到甲醇-水溶液(1∶9，V/V)作为淋洗剂比水更容易净化一些目标物的共吸附杂质，最终实验选择甲醇-水溶液(1∶9，V/V)作为淋洗剂。

同时实验还考察了甲醇-水溶液(1∶9，V/V)的用量(0.5～2.0 mL)对目标物回收率的影响，结果发现1.0 mL的甲醇-水溶液(1∶9，V/V)即可获得较好的淋洗效果且不会对目标物的回收率造成影响。因此，本实验选择1.0 mL的甲醇-水溶液(1∶9，V/V)作为淋洗剂。

2.5.3 洗脱剂的种类和用量洗脱条件的选择对整个固相萃取过程至关重要。贝类毒素在石墨烯吸附剂上的保留能力与毒素的亲脂特性、极性以及所带电荷状态有关，因此洗脱剂的酸碱性对贝类毒素在固相萃取柱上的洗脱效果特别重要[15]。本实验重点考察了1%的甲酸甲醇溶液、甲醇以及1%的氨水甲醇溶液作为洗脱剂时对毒素回收率的影响，结果见图3。从图3中可以看出，AZA1、AZA2、AZA3在碱性条件(回收率为86%～94%)的洗脱效果明显优于酸性和中性条件(回收率为75%～83%)。这可能的原因是AZAs分子结构中带有羧基而呈现酸性，碱性条件有利于AZAs离子化，进而降低了其与石墨烯表面的亲和力，对洗脱更加有利[10,16]。为确保分析物被洗脱完全且不浪费洗脱剂，实验对洗脱剂的体积进行了优化，发现1.0 mL的洗脱剂即可将3种AZAs贝类毒素洗脱完全。因此，本实验选择1.0 mL 1%的氨水甲醇溶液作为洗脱剂。

图3 不同种类的洗脱剂对3种原多甲藻酸贝类毒素回收率的影响(n=3)Fig.3 Effect of different types of elution solvents on the recoveries of three AZAs(n=3)

2.6 方法学验证

2.6.1 线性范围和灵敏度为了降低基质效应对AZAs贝类毒素定量造成的影响，本实验按照1.4节的方法制作基质标准曲线。根据信噪比(S/N)=10确定目标物的定量限(LOQ)。样品中3种AZAs贝类毒素的LOQ均为1.0 μg/kg。表2列出了3种AZAs贝类毒素的线性范围、基质标准曲线、相关系数、定量限。由表2可知，3种AZAs贝类毒素的线性关系良好，灵敏度较高。说明本方法适用于3种AZAs贝类毒素的定量分析。

表2 3种原多甲藻酸贝类毒素的线性范围、基质标准曲线、相关系数和定量限

2.6.2 准确度和精密度选取阴性牡蛎作为空白基质样品，分别添加3个浓度水平的AZAs贝类毒素混合标准溶液，每个浓度水平做6个平行样，按本方法进行准确度和精密度实验。结果如表3所示，AZA1、AZA2和AZA3的回收率为78.5%～102%，相对标准偏差(RSD)为3.25%～13.2%。表明该方法的准确度高，重复性好，满足3种AZAs贝类毒素的日常检测要求。

表3 空白样品添加3种原多甲藻酸贝类毒素的回收率和精密度(n=6)

2.7 与其他方法比较

将本实验建立的G -PT-SPE结合HPLC-MS/MS分离分析AZAs贝类毒素的方法与国内外已报道的检测方法进行对比(表4)。本实验建立的方法具有线性范围宽、灵敏度和准确度高等优点。更为重要的是，本实验建立的方法吸附剂用量更少，成本更低。这表明基于石墨烯的管尖固相萃取技术具有较好的应用前景，可以作为一种用于提取贝类中AZAs贝类毒素的简便、快速、低成本的样品前处理方法。

表4 与其他检测原多甲藻酸贝类毒素的方法对比

(续表4)

2.8 实际样品检测

采用已经建立的方法对30个贝类样品进行分析检测，均未检出AZAs贝类毒素。

3 结论

本实验以自制的石墨烯-管尖固相萃取装置对贝类样品中3种AZAs贝类毒素进行萃取净化处理，通过对石墨烯用量、淋洗剂种类和用量、洗脱剂种类和用量等影响固相萃取的条件进行优化，建立起一种石墨烯-管尖固相萃取结合高效液相色谱-串联质谱测定贝类样品中3种AZAs贝类毒素的方法。本实验建立的方法简单、经济、高效，适用于实际贝类样品中3种AZAs贝类毒素的检测，拓展了石墨烯在复杂生物基质样品前处理领域的应用。