树枝状表面增强拉曼散射基底制备及孔雀石绿痕量检测

赵静晨,黄丹丹,朱树华

(山东农业大学化学与材料科学学院,山东 泰安 271018)

表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)是一种分析速度快、检测灵敏度高的分析方法[1],在痕量有机物和食源性致病微生物检测等方面有着广泛的应用[2-4]。研究发现,纳米结构表面附近的分子振动光谱信号强度急剧增强[5],因此,制备能增强拉曼信号的纳米结构SERS基底成为SERS研究中的热点问题。金纳米材料是人们最早发现、研究最多的纳米材料之一[6],由于具有表面增强拉曼活性,常被用作SERS基底[7-9],金纳米粒子(gold nanoparticles,Au NPs)作为SERS基底在食品安全检测领域[10-14]的应用研究受到国内外广泛的关注。近年来研究发现,具有尖锐的边缘结构、纳米尺度的节点以及大的比表面等特殊结构的Au NPs具有优越的SERS增强效果,较完整的具尖锐边角的树枝状结构则更加突出[15-18],在SERS检测领域应用广泛。Feng Jiuju等[19]以聚乙烯基乙基咪唑溴化物为稳定剂制备的树突状结构具有均匀、多级分支,用作SERS基底检测4-巯基苯甲酸检出限为2×10-8mol/L。

杀菌剂孔雀石绿(malachite green,MG)及其在生物体内代谢产生的隐形孔雀石绿(leucomalachite green,LMG)具有高毒性、易残留和致癌性等安全隐患,我国早己将MG列为水产养殖中的禁用药物,但由于价格低廉,其使用屡禁不止[20-21]。徐宁宁等[22]将金核壳纳米粒子作为SERS基底对罗非鱼鱼肉中的MG含量进行加标检测,检出限为1×10-8mol/L,加标回收率为70.8%～126.0%。Yang Nan等[23]研究了金纳米棒聚合物的SERS膜对鱼皮表面MG的检测,检出限低于我国标准限量。

本实验以十二烷基甲基溴化哌啶(N-methyl-N-dodecylmorpholinium bromide,C12PDB)作为表面活性剂,用抗坏血酸还原氯金酸(chloroauric acid,HAuCl4)制备树枝状Au NPs,研究体系树枝状结构的生长过程。以罗丹明6G(rhodamine 6G,R6G)为探针分子探究树枝状Au NPs作为SERS基底的检测灵敏度和结果重复性。以树枝状Au NPs为SERS基底对水溶液及鲫鱼肉提取液中的MG进行检测,探究MG溶液的检出限,以期实现SERS光谱对MG的痕量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲫鱼购于山东泰安市某超市。

氯金酸、抗坏血酸、乙酸铵(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;R6G(纯度95%)、LMG(纯度98%) 阿拉丁试剂有限公司;MG(分析纯) 天津市巴斯夫化工有限公司;盐酸羟胺(分析纯)、盐酸 天津凯通化学试剂有限公司;二乙二醇(纯度98%)、碱性氧化铝 麦克林试剂公司。实验中用水均为实验室自制双蒸水。

1.2 仪器与设备

JEM-1400PLUS透射式电子显微镜、JSM-6610LV扫描式电子显微镜 日本电子株式会社;UV-2700紫外-可见分光光度计 日本岛津公司;Smartlab SE X射线粉末衍射仪 日本理学公司;XploRATMPLUS激光拉曼光谱仪 法国Horiba Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 树枝状Au NPs的合成和表征

取38.79 mL一定浓度的C12PDB(依文献方法自制[24-25])溶液,加入0.21 mL 1%的HAuCl4溶液,混匀后加入1 mL新鲜配制的0.1 mol/L的抗坏血酸溶液,快速混匀后室温静置6 h,即得到Au NPs样品。将铜网浸入反应液30 s后取出自然晾干,用透射式电子显微镜分析样品形貌;用紫外-可见分光光度计检测样品吸光度,波长范围400～800 nm。将反应液4 ℃、10 000×g离心20 min,下层沉淀用双蒸水洗涤后超声分散在4 mL无水乙醇中制得样品分散液,备用。

1.3.2 树枝状Au NPs的SERS活性

称取96 mg R6G溶于200 mL双蒸水中制得母液,浓度为10-3mol/L。稀释母液配制10-9～10-6mol/L浓度的R6G溶液。取10 μL树枝状Au NPs分散液滴在洁净的载玻片上,使液滴的半径不超过0.5 cm,在不受污染的室温环境下自然干燥,重复数次使其在显微镜下可见,得到载有SERS基底的载玻片,用扫描式电子显微镜分析基底表面分布。取R6G溶液滴在SERS基底上,自然干燥,制得R6G检测样品片。取适量R6G粉末在洁净的载玻片上压实,制备普通拉曼检测样品片作为对照。用硅片520.7 cm-1峰进行拉曼仪器的校正,拉曼光谱检测时选用638 nm激发波长和50 倍物镜,激光功率为1.5 mW,曝光时间10 s并重复3 次测量取平均值。

1.3.3 MG的SERS检测

称取73 mg MG溶于200 mL双蒸水中,稀释母液配制3×10-9～10-6mol/L浓度的MG溶液。称取66.1 mg LMG溶于200 mL双蒸水中,稀释母液配制10-5mol/L浓度的LMG溶液。取10 μL MG和LMG溶液滴加到制备的SERS基底上,自然干燥,制得MG检测样品片。同时取适量MG粉末在洁净的载玻片上压实,制备普通拉曼检测样品片,检测条件与1.3.2节相同,重复3 次测量取平均值。

依照参考文献[22,26],取4 g鱼肉样品,置于研钵中,加入0.3 mL 20%盐酸羟胺和2 mL 0.1 mol/L乙酸铵,用盐酸调节溶液至pH 4,对其进行研磨约1 h。将提取液转移至50 mL锥形瓶中,用6 mL乙腈洗涤研钵,转移至锥形瓶中,加入2 g碱性氧化铝后,振荡10 min,有沉淀生成。转移至10 mL离心管内,4 ℃、8 000×g离心15 min,上清液转移至分液漏斗中,加入10 mL水、5 mL二氯甲烷和0.2 mL二乙二醇,剧烈振摇分液漏斗萃取1 h。将萃取液分成6 份每份0.45 mL,分别添加0.05 mL水和不同浓度的MG标准溶液混匀,使MG浓度为3×10-9～1×10-6mol/L,取10 μL待测液滴加到制备的SERS基底上,自然干燥,制得鱼肉提取液MG检测样品片,检测条件与1.3.2节相同,重复3 次测量取平均值。

1.4 数据统计分析

实验结果运用Excel软件进行数据统计分析并绘制表格;运用Origin绘图并进行线性拟合。其中SERS增强因子的计算公式如下:

式中:EF为增强因子;ISERS为在树枝状Au NPs基底上收集的1×10-6mol/L(CSERS)R6G SERS谱图中某一特征峰的拉曼信号强度;CRaman为能产生普通拉曼信号的R6G溶液的浓度,为1×10-3mol/L,其在同一特征峰处的拉曼信号强度为IRaman。

2 结果与分析

2.1 树枝状Au NPs的制备与表征

图1 Au NPs的透射式电子显微镜图像Fig. 1 TEM images of the Au NPs at different reaction times

随着反应进行,被还原的金颗粒逐渐吸附在晶核上,受表面活性剂在晶核特定晶面吸附的影响,晶体在不同的反应阶段于特定的方向上生长。透射式电子显微镜照片(图1)可以观察到,当C12PDB/HAuCl4浓度比为4.6时,Au NPs的形态随反应时间的延长而不断变化,最终形成具有各向异性生长的一、二级枝茎结构及三级结构的树枝状结构。X射线衍射图谱(图1f)中在38.2°、44.4°、65.6°、77.5°和81.7°出现明显衍射峰,表明所制备的树枝状结构Au NPs具有很好的结晶性,各衍射峰分别对应Au(111)、Au(200)、Au(220)、Au(311)和Au(222)晶面,即此Au NPs为具有面心立方结构的金晶体(JCPDS No.04-0784)。

2.2 C12PDB/HAuCl4浓度比对Au NPs形貌的影响

图2 C12PDB/HAuCl4浓度比为2（a）、4.6（b）、12（c）时Au NPs的透射式电子显微镜图像及相应紫外-可见吸收光谱（d）Fig. 2 TEM images of Au NPs synthesized at different concentrationratios of C12PDB/HAuCl4: 2 (a), 4.6 (b), 12 (c), the corresponding UV-vis spectra (d)

为了研究表面活性剂浓度的变化对最终产物形貌的影响,对不同C12PDB/HAuCl4浓度比下制得的Au NPs的形貌进行了表征。透射式电子显微镜照片(图2)可以观察到,C12PDB浓度的变化对最终产物的形貌影响较大。紫外-可见光谱(图2d)中在500 nm波长到近红外区域均有很宽的紫外吸收带,其中浓度比为4.6时,树枝状Au NPs在570 nm波长附近有较明显的紫外吸收峰,这属于多级分支横向局部表面等离子体共振。对比图2a～c可看到只有当浓度比为4.6时得到产物的树枝状结构对称完美,本实验中以此条件下制备的Au NPs用于进一步检测。

2.3 树枝状Au NPs的SERS活性

为了探究树枝状Au NPs的SERS性能,制备了树枝状Au NPs SERS基底并以R6G为探针分子收集了拉曼信号。Au NPs基底照片(图3a),可以观察到明显的金棕色Au NPs沉淀附着在载玻片表面。从树枝状Au NPs基底的扫描式电子显微镜图(图3b)可知基底表面的树枝状Au NPs大都聚集在一起,形成均匀的致密堆积。由图3c可知,在没有增强基底的情况下,作为对比的R6G普通拉曼谱线接近于平线,难以观察到明显的特征峰,而树枝状Au NPs基底对R6G具有显著的SERS增强作用。据研究[27-28],谱图中所标示的特征峰分别归属于C—C—C面内弯曲振动(613 cm-1)、 C—H面外弯曲振动(774 cm-1)、C—H面内弯曲振动(1 185 cm-1)、C—O—C伸缩振动(1 311 cm-1)、C—C伸缩振动(1 361、1 510、1 574、1 649 cm-1)。不同浓度R6G(10-9～10-6mol/L)的SERS信号的强度随着R6G浓度的降低而降低,当浓度低至3×10-9mol/L时仍可识别这些特征峰。而Sun Hongbao等[28]在SERS胶带上收集的R6G的特征峰在浓度不低于5×10-8mol/L时才能被辨识。显然,树枝状Au NPs具有很好的SERS活性,大大增强了拉曼信号。计算可知这些特征峰强度与R6G浓度(3×10-9～3×10-7mol/L)的对数具有良好的线性关系。线性回归方程:I(613 cm-1)=24 994.4+2 638.1 lg C,R2= 0.992;I(774 cm-1)=22 284.9+2 263.9 lg C,R2= 0.992;I(1 510 cm-1)=24 549.7+2 510.5 lg C,R2= 0.990;I(1 649 cm-1)=18 995.3+1 906.8 lg C,R2= 0.996。以上结果表明制备的树枝状Au NPs作为SERS基底表现出较好的拉曼增强效果且具有较高的灵敏度。

图3 树枝状Au NPs基底照片（a）、扫描式电子显微镜照片（b）、不同浓度R6G的SERS谱图和R6G的普通拉曼图（c）和1×10－6 mol/L R6G在树枝状Au NPs基底上的10 个随机点的SERS谱图（d）Fig. 3 Photograph (a) and SEM image (b) of dendritic Au NPs substrate, original Raman spectra and SERS spectra for R6G (c) and SERS spectra for 1 × 10−6 mol/L R6G from 10 random locations on the dendritic Au NPs substrates (d)

同时,在基底上10 个随机点收集1×10-6mol/L R6G的SERS光谱研究SERS基底的检测结果重复性,如图3d所示,所获得的10 个SERS谱图都显示出非常相似的形状和信号强度,R6G的所有拉曼特征峰的相对强度基本不变。计算10 个SERS谱图的部分特征峰强度分布可知,在613、774、1 510 cm-1和1 649 cm-1处强度的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为9.70%、6.99%、9.25%和8.77%,均低于10%,低于Sun Hongbao等[28]近16%的RSD值,表明制备的树枝状Au NPs基底的SERS检测结果具有良好的重复性。将图3中测得的SERS信号强度,计算增强因子[29],可知制备的SERS基底对R6G具有较高的增强因子[18,30],分别为1.4×105(613 cm-1)、1.3×105(774 cm-1)、1.5×105(1 510 cm-1)、7.6×104(1 649 cm-1)。

2.4 MG的SERS检测

图4 1×10－5 mol/L LMG和MG的SERS光谱（a）、不同浓度MG在树枝状Au NPs基底上的SERS光谱（b）和1 168 cm－1特征峰的SERS强度与MG浓度对数的线性关系（c）Fig. 4 SERS spectra for 1 × 10－5 mol/L LMG and MG (a), SERS spectra for MG on the dendritic Au NPs substrates (b), and linear relationship between the SERS intensity of the characteristic peak at 1 168 cm–1 and the logarithm of MG (c)

图4 a为MG和LMG溶液在树枝状Au NPs基底上的SERS光谱图,可以观察到二者的SERS谱图的形状和信号相对强度无明显差异[31],主要的拉曼特征峰位置相同,因此选择MG为主要检测对象进行后续实验。图4b为在树枝状Au NPs基底上收集的MG(3×10-9～1×10-6mol/L)SERS谱图,SERS信号的强度随着MG浓度的降低而降低。SERS光谱图特征峰[22-23]归属分别为C—H面外弯曲振动(792 cm-1)、环骨架径向振动(913 cm-1)、C—H面内弯曲振动(1 1 6 8、1 2 1 4 c m-1)、苯环伸缩振动(1 363、1 389 cm-1)和C—C伸缩振动(1 288、1 585、1 613 cm-1)。当浓度低至1×10-8mol/L时仍能够检测出这些特征峰的微弱信号,而在更低浓度下则不易识别。与前人研究报道的被检测物拉曼信号强度随浓度变化趋势相似[32],在1×10-8～1×10-5mol/L范围内,随着MG浓度的增大,SERS信号强度呈增长趋势,起初增长速度缓慢,当MG浓度大于3×10-7mol/L时,SERS信号急剧增强(图4c)。当浓度在1×10-8～3×10-7mol/L之间时,1 168 cm-1的振动峰信号强度与MG浓度的对数之间具有良好的线性关系,线性回归方程为I= 15 616.6+1 610.1 lgC,R2= 0.995。结果表明,树枝状Au NPs作为SERS基底灵敏度较高,可检出痕量浓度的MG。

将鲫鱼肉提取液样品和添加MG溶液(3×10-9～1×10-6mol/L)的鲫鱼肉提取液样品进行SERS检测。由图5可知,空白的Au NPs基底的SERS谱图接近平线,对MG检测无影响。鲫鱼肉提取液样品中未检出MG的拉曼信号,而加标鱼肉提取液样品中MG的SERS谱图与MG标准溶液的SERS谱图形状相似,但由于鱼肉中其他非目标物质的干扰,SERS信号强度稍低于相同浓度的标准溶液,样品加标回收率为81.6%～102.1%,RSD为3.68%～7.98%(表1)。结果表明,树枝状Au NPs SERS基底可用于鲫鱼肉中MG的检测,此类SERS基底对鲫鱼中MG的测定结果可靠。

图5 鲫鱼肉提取液及其加标回收样品的MG在树枝状Au NPs基底上的SERS光谱Fig. 5 SERS spectra for MG in C. auratus extract without and with MG standard addition on the dendritic Au NPs substrates

表1 加标鲫鱼肉中MG的回收率（n= 3）Table 1 Recoveries of MG in C. auratus (n= 3)

3 结 论

本实验提出了一种利用表面活性剂辅助快速制备树枝状Au NPs SERS基底的方法,研究不同的C12PDB/HAuCl4浓度比对树枝状结构的影响。制得的树枝状Au NPs作为SERS基底具有优异的拉曼活性且结果重复性较好,可测得最低浓度为3×10-9mol/L时R6G的拉曼特征峰,SERS增强因子约为105。此类树枝状Au NPs作为SERS基底可检测水溶液中的MG检出限为1×10-8mol/L,对鲫鱼肉样品中的MG加标回收率为81.6%～102.1%,可实际应用于鱼肉中的MG检测。本研究对食品安全检测中SERS分析技术的应用具有重要意义。