基于多元统计方法分析陈酿条件对浙江玫瑰醋香气成分的影响

穆晓静,方冠宇,蒋予箭

(浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江 杭州 310018)

陈酿是食醋色泽、香气、体态形成的重要环节,近年来对食醋、酒类等发酵性食品陈酿的研究多集中在人工催陈技术上,包括臭氧催陈[1]、微波催陈[2]、红外线催陈[3]、超声波催陈[4]、超高压催陈[5]等,由于这些人工催陈技术存在一定弊端,还没有一种高效、安全、稳定、低成本的技术应用到大规模生产中,自然陈酿仍在沿用。温度是影响自然陈酿的一个重要因素,高本杰[6]研究了温度对高纯度白酒后熟过程风味的影响,结果表明适当增加温度可加快白酒的老熟;王程成[7]研究表明温度对风味物质葫芦巴内酯在黄酒陈酿过程中的形成起到了决定性的作用;黄文韬[8]将山西老陈醋新醋分别在低温和高温下陈酿,结果表明高温条件下,酯化反应、氧化反应和羰氨反应均较快,有利于后熟。

浙江玫瑰醋因其色泽鲜亮透彻,酸味柔和协调,酸中带甜成为食醋中的上乘佳品[9-10]。过去受气候的影响和发酵设备的限制,浙江玫瑰醋的生产形成了春投料、夏发花、秋发酵、冬陈酿的固定模式,陈酿过程多在冬季进行且占地面积大,陈酿周期长导致资金周转慢。近几年随着发酵设备改进[11],玫瑰醋实现了一年多次生产,发酵结束后需要几个月甚至1～3 a的陈酿方可食用。目前有关陈酿条件对玫瑰醋陈酿过程中风味物质的影响研究较少,实际生产中对陈酿效果的判断多以经验为主。

陈酿温度和陈酿时间是影响陈酿过程中玫瑰醋香气成分变化的2 个重要因素,香气成分是衡量浙江玫瑰醋质量的重要指标,本研究就现有的自然陈酿技术,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)技术对不同温度和时间下陈酿的浙江玫瑰醋中挥发性成分进行测定,再结合主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)等多元统计分析方法对测定结果进行统计分析,将温度、陈酿时间对玫瑰醋中风味物质的影响用科学的数据进行解释分析,以期为工业生产中玫瑰醋的陈酿提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浙江玫瑰醋醋样:鲜醋(未经陈酿)分别由绍兴至味食品有限公司、湖州老恒和酿造有限公司、新昌县天姥食品有限公司、浙江五味和食品有限公司提供,醋样均为浙江玫瑰醋原酿汁,陈酿前总酸均为6.8 g/100 mL,实验室里完成贮藏,样品具体信息见表1。

2-乙基丁酸(色谱纯) 广州市江顺化工科技有限公司;无水乙醇(分析纯) 无锡市展望化工试剂有限公司;NaOH标准溶液(0.05 mol/L)(分析纯) 西陇科学股份有限公司。

表1 醋样信息Table 1 Detailed information about vinegar samples tested in this study

1.2 仪器与设备

BCD-215DK恒温培养箱 青岛海尔股份有限公司;SPX-250B-Z冰箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;DVB/CAR/PDMS萃取头(50/30 µm) 美国Supelco公司;7890A-5975C GC-MS联用仪 美国Agilent公司;HH-6数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME条件

取样品12.5 mL置于20 mL顶空瓶中(检测前将样品放4 ℃冰箱中使样品温度一致),再加100 μL内标物(2-乙基丁酸),用带有硅橡胶隔垫的瓶盖密封。将顶空瓶放入50 ℃水浴锅平衡30 min,然后将己在240 ℃进样口老化至无杂峰的萃取头插入顶空瓶中距离液面1 cm处,50 ℃吸附30 min,取出后插入GC进样口,240 ℃解吸2 min,进行GC-MS分析。

1.3.2 GC条件

色谱柱:DB-WAX色谱柱(60 m×0.25 mm,0.5 µm);进样口温度:240 ℃,不分流进样,恒流模式,柱流速:1 mL/min;柱温:35 ℃保持3 min,以3 ℃/min升到220 ℃,保持10 min。

1.3.3 MS条件

离子源:电子电离源;离子源温度:230 ℃;四极杆温度:150 ℃;质量扫描范围:33～500 u;质谱谱库检索使用NIST 14数据库。

1.3.4 样品香气成分半定量分析

采用内标法对风味物质进行半定量分析,以159.18 mg/L 2-乙基丁酸(用体积分数20%乙醇溶液配制)为内标物[12]。

1.4 数据分析

用Origin 9和Excel对数据进行处理和统计,IBM SPSS Statistics 22比较香气挥发物之间的差异性,结果表示为,P＜0.05,差异显著;用SIMCA 14.2软件进行PCA,在PCA的基础上,根据样品的聚类趋势,对样品人为归类后进行OPLS-DA,并绘制PCA得分图、HotellingT2分布图、OPLS-DA得分图和模型置换验证图、S-plot图。

2 结果与分析

2.1 不同陈酿条件下醋样香气成分组成及质量浓度比较

香气是衡量浙江玫瑰醋品质的一项重要指标,然而刚酿造好的新鲜玫瑰醋口感生硬,酸味刺激,杂味较浓,香气单薄,不宜食用,因此要经过陈酿环节,增加食醋风味物质使其香气协调。本实验采用SPME-GC-MS技术对不同条件下陈酿的16 种醋样中挥发性风味物质进行检测,所得GC-MS检测结果通过计算机NIST 14谱库和人工检索处理,选出匹配度不小于80%的化合物并参考文献[13-14]进行定性定量分析,结果见表2。

表2 不同陈酿条件下浙江玫瑰醋中挥发性成分质量浓度Table 2 Volatile components in Zhejiang rosy vinegar under different aging conditions μg/L

续表2 μg/L

续表2 μg/L

图1 醋样在不同陈酿条件下的各类挥发性成分总量比较Fig. 1 Comparison of the total content of each class of volatiles in rosy vinegar samples under different aging conditions

每个醋样中质量浓度最高的醇类均为苯乙醇,这种物质具有清淡玫瑰花香,目前被鉴定为酒中重要的芳香族化合物[15],也是玫瑰醋中贡献率较大的一种醇类物质,其次为乙醇和异戊醇。由图1可以看出,高温陈酿5 个月、常温陈酿2.5 a比低温、常温陈酿5 个月的醋样醇类总质量浓度显著降低(P＜0.05),刘源等[16]研究表明,在陈酿过程中醇类被氧化为醛、酸,以及与酸类物质发生酯化反应,使醇类质量浓度降低,尤其是乙醇质量浓度。乙醇质量浓度的降低使食醋的口感变得绵软柔和[17]。本研究表明温度越高,醇类物质下降越明显。

每个醋样中检测出7 种酸类化合物,除了主体乙酸外,质量浓度较高的为异丁酸、异戊酸和辛酸,其中异丁酸具有牛奶香、酸味香、水果香和脂肪香的组合香气,赋予浙江玫瑰醋较好风味[18]。由表2和图1可以看出,陈酿温度和时间对玫瑰醋中异丁酸质量浓度影响不显著(P＞0.05),对乙酸影响显著(P＜0.05)。陈酿温度越高,时间越久,乙酸质量浓度越低,总酸质量浓度也越少,该结果与黄文韬[8]研究结果一致。说明醋经陈酿后,伴随着酯化反应和挥发酸的挥发,总酸质量浓度降低,但剩余的不易挥发酸使食醋酸味更加柔和,高温更有利于反应的进行。

酯类物质是醋样中检测到的种类最多、质量浓度最高的风味物质。质量浓度较高的酯类有乙酸乙酯、2-苯乙基乙酸酯、乙酸异戊酯、二乙基丙二酸乙酯。陈酿过程中酯类的形成途径主要是在酯酶的催化下由酸类物质与相应的醇类物质发生酯化反应,或是乙酰辅酶A在醇酰基转移酶的作用下和相应的醇类缩合而成[19-20],绝大多数的酯类具有花香、果香和蜂蜜香,是大多数食醋风味的重要来源。由图1可知,高温5 个月陈酿醋中酯类物质质量浓度比低温和常温陈酿相同时间的醋显著降低(P＜0.05),常温2.5 a陈酿醋中酯类物质质量浓度略有下降,该结果说明温度对玫瑰醋中酯类物质质量浓度影响较大,温度越高,酯类物质减少量越大。

醛、酮、酚及其他物质在醋样中检测到质量浓度及种类较少,酚类最少,但酚类物质的气味阈值较低,构成玫瑰醋特有的香气[21-22]。苗志伟等[23]研究表明,糠醛、3-羟基-2-丁酮、丁二酮等物质对山西老陈醋特征香气起重要作用,这些物质多在陈酿过程中产生。由表2看出,高温5 个月陈酿醋和常温2.5 a陈酿醋中这些物质质量浓度显著增加(P＜0.05),其中糠醛主要来自于美拉德反应和酸催化条件下的糖降解反应,是食品中褐色的主要来源[24],影响着玫瑰醋的色泽。该结果表明高温陈酿更有利于糠醛、3-羟基-2-丁酮、丁二酮等物质的形成,为玫瑰醋提供特殊风味。

2.2 多元统计分析

2.2.1 基于PCA对不同陈酿条件下玫瑰醋的区分

近些年,随着多元统计分析方法的推广,越来越多的统计分析方法应用于同一物质不同品种间的化学识别[25-26]、香气指纹图谱的建立[27-28]、特征性香气成分分析[29]等方面的研究。其中PCA可大大降低数据的复杂度,并对数据进行可视化处理[30]。由于本实验所测样品的风味物质复杂且样品量较多,通过PCA可从数据之间错综复杂的关系中找到一些主成分,从而有效利用大量统计数据进行分析,因此采用PCA对测定结果进行分析,提取4 个主成分,累计贡献率为64.26%,基本可以反映整体样本信息。

图2 PCA得分图（a）和Hotelling T2分布图（b）Fig. 2 PCA score plot (a) and Hotelling T2 value range plot (b)

由图2a可以看出,16 种醋样呈现极明显的区域分布特性,被分为4 类:A类醋样(#1、#2、#3、#4)均为0～5 ℃低温下陈酿5 个月的玫瑰醋;B类醋样(#5、#6、#7、#8)均为常温下陈酿5 个月的玫瑰醋;C类醋样(#9、#10、#11、#12)均为高温下陈酿5 个月的玫瑰醋;D类醋样(#13、#14、#15、#16)均为常温下陈酿2.5 a的玫瑰醋。说明不同陈酿条件下的玫瑰醋风味物质有明显差异,但由于PCA是无监督分析模型,不能去除未控制变量对数据造成的影响,从而使部分不同条件下陈酿的玫瑰醋(如#12、#13)区分不明显,但由图2b可看出,所有样品均在95% Hotelling T2置信区间内,未发现超出该置信区间的样本,可进一步对样品中风味物质进行OPLS-DA。

2.2.2 基于OPLS-DA对不同陈酿条件下玫瑰醋的区分

图3 OPLS-DA得分图（a）和OPLS-DA模型置换验证图（b）Fig. 3 Score plot of OPLS-DA (a) and permutation test plot (b)

OPLS-DA是在PCA基础上再进行计算分析的一种方法,但相比于PCA,OPLS-DA属于有监督分析,可通过预设分类,尽可能去除未控制变量对数据造成的影响,可进一步挖掘数据信息,同时可以量化特征风味物质造成样品之间差异的程度[31-32]。本实验根据PCA的聚类趋势,将同一条件下陈酿醋作为Y变量进行OPLS-DA。

由图3a可看出,分别在低温和常温下陈酿5 个月的醋样(A类和B类)极其靠近,但是这2 类醋样远离常温陈酿2.5 a的D类醋,说明D类醋与A、B类成分相差较大;而在高温下陈酿5 个月的C类醋与D类醋靠近,表明在高温下短时间陈酿的玫瑰醋成分较接近常温下长时间陈酿的玫瑰醋。为验证该OPLS-DA模型的可靠性,对样本顺序进行随机置换,将建立OPLA-DA模型时定义分类Y的变量顺序随机排列200 次,得到的Q2值作为衡量模型是否过拟合的标准[33]。如图3b所示,R2和Q2回归线的斜率均大于1,且Q2回归线的截距小于0,结果表明该OPLS-DA模型可靠,未出现过拟合现象,可用于对实验中的16 种玫瑰醋样判别分析。因此用该模型进一步对不同玫瑰醋醋样中重要香气成分进行分析。

2.2.3 不同陈酿条件下玫瑰醋中重要香气成分差异分析

图4 OPLS-DA S-plot图Fig. 4 S-plot of OPLS-DA

为可视化OPLS-DA模型中的变量,分析造成2 类样品存在差异的标志性物质,S-plot图可得到变量投影重要性[34]。根据2 类存在差异的样品中挥发性物质含量数据,通过SIMCA软件做出S-plot图。为分析不同陈酿年份的玫瑰醋中重要香气成分差异,将B类醋与D类醋进行对比,S-plot见图4a。为分析不同陈酿温度对玫瑰醋中重要香气成分的影响,进一步对不同陈酿温度下的玫瑰醋进行对比,由于A类醋和B类醋样差异极小,因此只选择其中之一A类醋与C类醋进行对比,S-plot图见图4b。

OPLS-DA S-plot图S形左下方和右上方2 个角上的变量是区分两组样品的主要风味物质。由图4a得出,D8(糠醛)、E8(2,3-丁二酮)、E5(3-羟基-2-丁酮)、C1(乙酸乙酯)、A3(苯乙醇)、E6(3-乙酰基-2-丁酮)等是造成B类和D类醋样呈现差异的主要物质;玫瑰醋陈酿过程中糠醛、2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、乙酸乙酯、苯乙醇、3-乙酰基-2-丁酮等物质含量变化较大。

由图4b看出,C1(乙酸乙酯)、E8(2,3-丁二酮)、E6(3-乙酰基-2-丁酮)、D8(糠醛)是造成A类与C类醋差异显著的主要风味物质,说明玫瑰醋陈酿过程中温度对这几种物质影响较大。

为对每种陈酿条件的浙江玫瑰醋中重要香气成分分析,做出OPLS-DA因子荷载图,可反映每一个变量在得分图上的贡献。

图5 OPLS-DA因子荷载图Fig. 5 Loading factors plot of OPLS-DA

从图5可以看出,E3(4-甲基-2-戊酮)、C19(2-甲基巴豆酸异戊酯)、C11(2-乙基丁酸-2甲基丙基酯)、A1(乙醇)、C1(乙酸乙酯)等物质是低温后熟玫瑰醋(#1、#2、#3、#4)和常温后熟玫瑰醋(#5、#6、#7、#8)中的特征性风味物质;C16(3-乙氧基乙酸丙酯)、C18(2-乙基丁酸-庚-4-基酯)、C30(2-乙基丁酸-3-甲基-苯基酯)、C37(邻苯二甲酸二庚酯)等是高温后熟玫瑰醋的重要香气物质,常温陈酿2.5 a的玫瑰醋(#13、#14、#15、#16)主要香气成分是C26(乙酸苯甲酯)、F2(2,4-二叔丁基苯酚)、D8(糠醛)、E8(2,3-丁二酮)、B2(异丁酸)、D10(2-羟基苯甲醛)等风味物质。

综上所述,温度对玫瑰醋的陈酿后熟影响较大,冷藏后熟的玫瑰醋和常温后熟的风味接近,但与高温下陈酿相同时间的玫瑰醋风味差异较大,高温陈酿5 个月的玫瑰醋风味接近常温下陈酿2.5 a的玫瑰醋,说明高温下玫瑰醋中的物质发生各类化学反应较快,更有利于风味物质的形成,因此可推断高温陈酿对浙江玫瑰醋有催陈作用。

3 结 论

采用SPME-GC-MS技术对不同陈酿条件下的浙江玫瑰醋中挥发性成分醇类、酸类、酯类、醛类、酮类、酚类进行定性半定量检测,结果表明,高温(35～40 ℃)陈酿5 个月的玫瑰醋和常温下陈酿2.5 a的玫瑰醋中醇类、酸类、酯类等均显著低于低温(0～5 ℃)、常温(20～25 ℃)陈酿5 个月的玫瑰醋,但酮类、醛类总含量普遍偏高,其中美拉德反应产物糠醛明显增多。

对数据进一步采用PCA、OPLS-DA等多元统计分析,结果看出PCA、OPLS-DA均可对不同陈酿条件的浙江玫瑰醋进行有效区分,其中高温陈酿5 个月的玫瑰醋和常温陈酿2.5 a的玫瑰醋靠得较近,低温陈酿5 个月和常温陈酿5 个月的玫瑰醋靠得近,说明高温陈酿可缩短陈酿周期。

通过OPLS-DA S-plot图得出:1)玫瑰醋陈酿过程中糠醛、2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、乙酸乙酯、苯乙醇等物质含量变化较大;2)玫瑰醋陈酿过程中温度对乙酸乙酯、苯甲醛、2,3-丁二酮、糠醛等物质影响较大。

OPLS-DA荷载图得出:4-甲基-2-戊酮、2-甲基巴豆酸异戊酯、2-乙基丁酸-2甲基丙基酯、乙醇、乙酸乙酯等物质是低温陈酿玫瑰醋和常温陈酿玫瑰醋中的特征性风味物质;3-乙氧基乙酸丙酯、2-乙基丁酸-庚-4-基酯、2-乙基丁酸-3-甲基-苯基酯、邻苯二甲酸二庚酯等是高温陈酿组玫瑰醋的主要呈味物质,常温陈酿2.5 a的玫瑰醋主要呈味物质是乙酸苯甲酯、2,4-二叔丁基苯酚、糠醛、2,3-丁二酮、异丁酸、2-羟基苯甲醛等风味物质。