响应面法优化地骨皮总生物碱微波提取工艺研究

李新蕊，司明东，谢振元，温子帅，马东来，郑玉光

(河北中医学院 药学院，河北 石家庄 050200)

地骨皮为茄科植物枸杞(LyciumchinenseMill.)或宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的干燥根皮，地骨皮入药始载于《神农本草经》，春初或秋后采挖根部，洗净，剥取根皮，晒干。味甘，性寒，归肺、肝、肾经。具有凉血除蒸、清肺降火之功效[1]。现代研究表明地骨皮中含有多种化学成分，主要包括生物碱类、有机酸及其酯类、蒽醌类等，现代药理研究表明地骨皮具有解热镇痛、降血糖、降血压、降血脂、抗菌以及免疫调节等药理作用[2]。

从地骨皮中分离得到的生物碱类化合物对糖尿病、高血压等疾病有明显的抑制作用[3]，其中地骨皮甲素具有抑制糖尿病相关的淀粉样蛋白聚集作用[4]，地骨皮乙素可通过其与脂多糖结合抑制脂多糖诱导的感染性小鼠肝脏炎症反应[5]；甜菜碱具有降低TGF-β1和TNF-α水平的作用，从而在糖尿病肾病微血管炎症过程中起到延缓或抑制作用[6]。

响应面法(Response surface methodology)具有简便、预测结果精准等优点，目前广泛应用于化工、农业、制药等多个领域，是一种以统计学原理为基础，用于实验设计与优化的分析方法，通过建立体系的响应值与多个因素间的函数关系，评价各因素间的交互作用，更好地确定实验的最优条件[7-8]。本实验采用微波法提取地骨皮中总生物碱，利用紫外分光光度计测定地骨皮中总生物碱含量，通过Box-Benhnken设计-响应面法优化其提取工艺条件，为地骨皮中总生物碱资源综合开发利用提供参考。

1 仪器、试剂与药材

UV-2600型紫外可见分光光度计(日本岛津仪器有限公司)，Biotage Initiator+微波合成仪(Biotage Sweden AB)，盐酸小檗碱标准品(LOT：Y31J9H67024)购自上海源叶生物有限公司，冰乙酸、溴百里香酚蓝、三氯甲烷均购自天津市百世化工有限公司。

30批地骨皮药材分别购自河北安国、安徽亳州、成都荷花池药材市场，具体产地见表1。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的绘制

精密称取盐酸小檗碱2.5 mg，用甲醇定容到25 mL的容量瓶中，分别取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于分液漏斗中，加入pH=4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液10 mL、0.3%溴百里香芬兰溶液6 mL、氯仿20 mL，混匀，静置10 min后，分出氯仿层，加少许无水硫酸钠干燥，滤液定容于50 mL容量瓶中，于417 nm处测定吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标、盐酸小檗碱标准溶液的浓度X(mg/mL)为横坐标，进行线性回归，拟合得回归方程Y=37.249X-0.241 1，相关系数r值为0.996 5。

表1 地骨皮产地信息

2.2 供试品的制备

取0.5 g地骨皮S1样品加入12.5 mL的60%乙醇放于反应釜中，温度70 ℃，微波提取30 min，过滤，取3 mL滤液置于分液漏斗中，按“2.1”项下方法处理，在417 nm处测定吸光度。

2.3 方法学考察

在精密度试验中，精密量取同一浓度对照品溶液适量，于417 nm处测定吸光度，连续测定6次，RSD为0.02%，表明仪器精密度良好；在稳定性试验中，精密称取S1号样品0.5 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液6份，分别于室温下放置10、20、30、40、50、60 min后于417 nm处测定吸光度，结果RSD值为1.82%，结果表明供试品溶液60 min内稳定性良好；在重复性试验中，精密称取S1号样品0.5 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，于417 nm处测定吸光度，结果RSD值为2.27%，说明该方法重复性良好；在加样回收率试验中，精密称取已知总生物碱含量的S1号样品0.5 g，共6份，均加入适量标准品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，于417 nm处测定吸光度，结果RSD值为2.78%，说明该方法准确性良好。

2.4 Box-Benhnken设计-响应面法优化地骨皮总生物碱的微波提取工艺

2.4.1 试验设计 根据前期基础实验研究，选取液料比(A)、乙醇浓度(B)、微波温度(C)、微波提取时间(D)为自变量，总生物碱提取率作为响应值，采用Box-Benhnken-设计方案，在4因素3水平的基础上，运用响应面法优化地骨皮中总生物碱的最佳提取工艺，因素与水平见表2，试验设计与结果见表3。

表2 设计因素编码与水平

表3 响应面试验设计与结果

2.4.2 模型建立与方差分析 利用Design-Expert 8.0.6 Trial软件进行结果统计并分析处理结果如表3所示。对表3数据进行多元二次回归拟合，建立提取工艺参数回归模型，拟合回归方程为Y= 3.41 + 0.76A+0.25B+0.050C+0.27D+0.19AC-0.46CD- 0.64A2- 0.15B2- 0.36C2- 0.26D2。

表4 回归方程的方差分析

2.4.3 响应面分析 利用 Design-Expert 8.0.6 Trial软件分析，得出影响地骨皮中总生物碱提取率的各因素交互作用的相应响应面图，各因素对地骨皮中总生物碱提取率的影响见图1。从图1三维立体图中可以看出，a、b、c的曲面均陡峭，提示乙醇浓度与液料比之间、微波温度与液料比之间、微波时间与液料比之间交互作用均达到显著水平；d、e的曲面均不陡峭，提示微波温度与乙醇浓度之间、微波时间与乙醇浓度之间交互作用均未达到显著水平，但均存在极大值点[9]；图1f曲面较陡峭，提示微波时间和微波温度交互作用对地骨皮总生物碱提取率显著，这与方差分析结果基本一致。

由Design-Expert 8.0.6 Trial软件分析得出地骨皮总生物碱最大提取率为3.86%，最佳条件为液料比27.26∶1(mL∶g)、乙醇浓度70%、微波提取温度72.62 ℃、微波提取时间22.23 min。以实际操作的方便考虑，将其修正为液料比27∶1(mL∶g)、乙醇浓度70%、微波提取温度73℃、微波提取时间22 min。

2.4.4 验证试验 根据优化的最佳工艺条件，取地骨皮S1样品0.5 g进行3次平行试验，结果，总生物碱的平均提取率为3.81%，RSD为1.9%，与预测值3.86%的相对误差为1.30%，说明该工艺稳定可靠。

图1 各因素交互作用对总生物碱提取率之间的响应面

3 不同批次的地骨皮总生物碱含量

按“2.2”项下方法制备样品待测溶液，每个样品平行三次试验。结果见表6。

表6 30批次地骨皮中总生物碱的含量

4 讨论

地骨皮中化学成分复杂，且有效成分提取分离难度大，生物碱类是其次生代谢产物中较大的一类，不同批次地骨皮总生物碱含量在14.68～39.20 mg/g之间，总生物碱的提取含量影响着地骨皮的质量[10-11]。S17号河南产地骨皮总生物碱含量最高为39.20 mg/g，除甘肃外同一产地地骨皮总生物碱含量相差不大，安徽在25.87～32.71 mg/g之间、河南在26.18～39.20 mg/g之间、河北在24.52～30.97 mg/g之间，甘肃在14.68～35.50 mg/g之间。安徽、河南、河北所产地骨皮质量稳定，甘肃所产质量差异较大，因在市场所购药材，生长年限存放时间不能保持一致，可能会对含量有影响，本课题组后续将对其进行研究。

笔者在前期试验的基础上，通过Box-Benhnken设计-响应面法成功优化了地骨皮中总生物碱的提取工艺，最优条件为液料比27∶1(mL∶g)、乙醇浓度70%、微波提取温度73 ℃、微波提取时间22 min，且优化后的提取工艺合理可行，可为地骨皮中总生物碱的开发与利用提供参考。