三七-白及药对作用机制的网络药理学分析

朱亚玲， 杨紫薇， 高佳慧， 陈建美， 陈璐， 孔雅珍， 刁勇

(华侨大学 医学院， 福建 泉州 362021)

三七为五加科植物三七PanaxNotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根茎，具有散瘀止血、消肿定痛的作用，用于治疗咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外伤出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛等疾病[1].《本草纲目》记载三七“止血散血定痛，金刃箭伤、跌扑杖疮、血出不止者，嚼烂涂，或为末掺之，其血即止”[2]，临床应用发现，三七对冠心病、高血压、动脉硬化、肿瘤等多种疾病具有改善和治疗作用[3-4].白及为兰科植物白及Bletillastriata(Thunb.) Reichb.f.的干燥块茎，具有收敛止血、消肿生肌的功效，用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等疾病[1].《本草纲目》中记载“白及主痈肿恶疮，败疽，伤阴死肌，胃中邪气贼风鬼击，痱缓不收”[2].现代研究表明，白及具有促进伤口愈合、抗溃疡、止血、抗肿瘤和抗炎活性[5-6]的作用.此外，白及的活性成分还被广泛应用于食品、化妆品等行业[7].三七和白及同为止血药，二药相合，一散一收，去瘀生新，有止血而不留瘀的效果.白及多糖可增加三七总皂苷作用于胃肠道的药效[8].三七-白及药对在临床实践中应用广泛，但目前对于二者配伍的药理作用机制尚不明确.

网络药理学从整体角度描述生物系统、药物和疾病之间复杂的相互作用[9-11]，已被广泛应用于中药的潜在活性成分及其作用靶点预测、机制研究、药物开发、药效研究等过程，是开发创新药物的重要方法[12-14].本文利用网络药理学方法，筛选三七-白及药对的活性成分，并综合分析三七-白及药对作用靶点、相关的疾病和信号通路等，探索三七-白及药对的药理作用机制，进一步扩大药物使用范围，为“老药新用”提供依据.

1 材料与方法

1.1 三七和白及化学成分的检索与收集

采用中药系统药理学TCMSP数据库(http:∥lsp.nwu.edu.cn/index.php)[15]，分别以“三七”、“白及”作为关键词，检索2味中药已知的所有化学成分，以口服生物利用度(OB)≥30%，化合物类药性(DL)≥0.18作为筛选标准，获得三七和白及中符合筛选标准的化学成分信息，将其作为活性成分.

1.2 三七和白及活性成分靶点信息的收集

通过TCMSP数据库查找与活性成分相关的作用靶点，收集靶点蛋白信息.利用Uniprot数据库(http：∥www.uniprot.org/)[16]，将检索物种限定为“Homosapiens”，对收集的靶点蛋白名称进行统一校正，并获取靶点蛋白相对应的靶点基因.采用Cytoscape 3.6.1(https:∥cytoscape.org)软件[17]，以三七、白及、活性成分及靶点信息为基础，构建“药物-活性成分-靶点”网络图.

1.3 靶点基因相关疾病的获取

将靶点基因导入毒性与基因比较CTD数据库(http:∥ctdbase.org)[18]，富集分析这些基因相关的疾病，以校正P<0.01作为显著性标准，得到三七-白及药对靶点基因相关的疾病信息.

1.4 靶点蛋白相互作用网络构建和分析

利用蛋白相互作用网络STRING数据库(https:∥string-db.org/)构建靶点蛋白之间相互作用网络[19].将三七、白及相关的靶点蛋白导入STRING数据库，将研究物种设置为“Homosapiens”，最低互作分值设置成最高可信(HC)≥0.9，删除与其他蛋白无相互作用的节点，获得蛋白相互作用关系网络图，将互作网络数据导入Cytoscape软件，并用cytoHubba插件对网络进行分析，计算节点的度(degree)，筛选degree排名前5的节点蛋白，并将其作为核心蛋白.

1.5 靶点基因GO生物学过程与KEGG通路富集分析

将靶点基因导入生物学信息注释及可视化DAVID 数据库(https:∥david.ncifcrf.gov/home.jsp)[20]进行基因本体论(GO)富集分析及京都基因与基因百科全书(KEGG)通路富集分析，以基因在某条通路富集结果的可信度(Q)<0.05作为显著性标准，分析靶点基因参与的生物学过程及信号通路.

2 研究结果

2.1 三七-白及药对的活性成分

通过TCMSP数据库共收集到119个三七化学成分，36个白及化学成分，依据口服生物利用度(OB)≥30%，化合物类药性(DL)≥0.18进行筛选，共得到17个活性成分，其中,三七有8个，白及有9个.三七和白及活性成分,如表1所示.

表1 三七和白及活性成分Tab.1 Active ingredients in PanaxNotoginseng and Bletillastriata

2.2 作用靶点信息及药物-活性成分-靶点网络图

筛选得到的17个活性成分中，三七活性成分MOL007475和白及活性成分MOL005776未检索到相关作用靶点；15个活性成分共获得193个靶点蛋白，三七活性成分靶点有184个，白及活性成分靶点有27个；2味药物共同作用靶点有18个，分别为AR，DPP4，EGFR，ESR1，PRKACA，PPARG，KCNH2，PTGS1，PTGS2，RXRA，SCN5A，F2，PRSS1，NOS3，NCOA2，TOP2A，F7，PPARD.三七-白及药对既有不同作用靶点，又有共同作用靶点，提示三七和白及在用药过程中存在一定的协同或拮抗作用.

图1 药物-活性成分-靶点网络关系图Fig.1 Drug-active ingredient-target network

将三七、白及2味药物和15个活性成分及193个靶点蛋白导入Cytoscape软件，得到药物-活性成分-靶点网络关系图，如图1所示.图1中：网路共包含210个节点和336条边；红色六边形分别代表三七和白及；粉色圆形代表三七的活性成分；橙色圆形代表白及的活性成分；绿色菱形代表作用靶点；连接线代表相互关系.经Cytoscape软件分析，槲皮素(quercetin)作用靶点有150个，数量最多，其次为β-谷甾醇(beta-sitosteroll)37个和豆甾醇(stigmasterol)31个.从作用靶点角度分析，PTGS2相互作用活性成分数目最多，有12个，PTGS1相互作用活性成份有9个，SCN5A有8个.结果表明:前述活性成分和靶点蛋白在三七-白及药对疾病治疗过程中发挥重要作用，活性成分与靶点蛋白间复杂的相互作用关系体现了中药在应用中“多组分-多靶点”综合调节的特点.

2.3 靶点基因与相关疾病分析

将193个靶点基因导入CTD数据库，富集相关疾病，得到与靶点基因相关的疾病共有35类，前10类靶点基因相关疾病的富集，如表2所示.由表2可知：与癌症相关的疾病有124种，涉及139个靶点基因；其次为神经系统疾病,有83种，涉及116个靶点基因;心血管疾病有70种，涉及120个靶点基因，说明三七-白及药对可用于癌症、神经系统疾病、心血管疾病等的治疗.

表2 前10类靶点基因相关疾病的富集Tab.2 Enrichment of target gene related diseases (top 10)

图2 蛋白相互作用网络Fig.2 Protein interaction network

2.4 蛋白相互作用网络构建与核心蛋白获取

通过STRING数据库及Cytoscape软件分析，得到靶点蛋白相互作用网络，如图2所示.图2中：网络共包括167个节点和677条边；节点的大小表示degree值的大小，节点越大，对应的degree值越大，degree排名前5位的节点蛋白为AKT1(35)，MAPK1(34)，c-Jun(34)，P53(33)，TNF(31)，说明这些节点蛋白在相互作用网络中发挥关键作用，将其作为核心蛋白.

2.5 靶点基因GO生物学过程及KEGG通路富集结果

图3 前10条靶点基因生物学过程富集Fig.3 Biological process enrichment results of top 10 target genes

采用DAVID数据库对靶点基因进行富集分析，GO富集结果显示，靶点基因显著富集到91条生物学过程中，主要涉及药物反应(response to drug)、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、转录的正调控(positive regulation of transcription)、衰老(aging)、细胞增殖的正调控(positive regulation of cell proliferation)等.前10条靶点基因生物学过程,如图3所示.图3中：以Q<0.05作为显著性标准,Q越小越显著，气泡颜色越偏向红色，反之越偏向绿色；各条目相关基因数越多，气泡越大，反之越小.KEGG通路富集结果显示，靶点基因在66条通路显著性富集，主要包括癌症通路(pathways in cancer)、乙型肝炎(hepatitis B)、膀胱癌(bladder cancer)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)等，前10条靶点基因KEGG 通路富集，如表3所示.

表3 前10条靶点基因 KEGG 通路富集Tab.3 KEGG pathway analysis of (top 10) target genes

由富集到癌症通路的靶点基因数目最多，有53个.靶点基因与癌症通路，如图4所示.图4中：红色节点表示富集于癌症通路上的靶点基因.由图4可知：该结果与前述靶点基因相关疾病中癌症数目最多的结果相符，提示三七-白及药对在癌症相关疾病的治疗中具有潜在优势，可作为今后实验研究和临床实践的重要方向.

图4 靶点基因与癌症通路Fig.4 Target genes and pathways in cancer

3 讨论

中药在复杂疾病的治疗中考虑了疾病治疗的整体性，具有多组分、多靶点、多通路联合作用的特点[21].采用网络药理学方法对三七-白及药对进行研究，共得到17个活性成分与193个作用靶点.通过药物-活性成分-靶点网络分析显示：槲皮素、β-谷甾醇和豆甾醇等为网络的重要节点.槲皮素具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节的作用[22-24]，可用于治疗肥胖、心血管疾病、糖尿病和癌症等疾病[25-27].槲皮素通过上调Bax蛋白表达，调控MAPK信号通路，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而诱导A375SM细胞凋亡，发挥抗黑色素瘤的作用[28].β-谷甾醇具有广泛的抗癌药理活性，可下调 P13K/AKT/mTOR信号通路蛋白的表达，诱导 SGC-7901 细胞发生自噬，从而抑制胃癌细胞的增殖并促进其凋亡，发挥抗胃癌作用[29].实验研究发现，β-谷甾醇还能促进肝癌移植瘤IFN-γ 表达并抑制IL-6 表达，降低血清VEGF 水平，发挥抗癌作用[30].豆甾醇能够显著降低COX-2 和CSF-1蛋白的表达，抑制NF-κB通路激活，改善硫酸右旋糖酐所致结肠炎，发挥抗炎活性[31].豆甾醇可通过上调促凋亡蛋白Bax和P53表达，并下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，诱导肝癌细胞凋亡[32].网络中靶点蛋白PTGS2，PTGS1，SCN5A等可与多个活性成分相互作用，体现了三七-白及药对多组分、多靶点协调作用的特点.靶点基因-疾病网络分析发现，与193个靶点基因相关的疾病共有35类，主要涉及癌症、神经系统疾病、心血管疾病等，说明三七-白及药对在癌症、神经系统疾病、心血管疾病等的治疗中具有潜在药效作用.

根据蛋白相互作用网络分析，得到核心蛋白AKT1，MAPK1，c-Jun，P53，TNF等，在三七-白及药对药理作用过程中发挥关键作用.AKT1为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调节包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成等生物过程[33-34]，在胰岛素信号传导、血管生成和肿瘤形成等方面起着重要作用[35-36].MAPK1参与细胞增殖、分化、转录调控和发育等过程，与多种癌症的治疗密切相关，miR-329-3p可直接抑制MAPK1表达，从而抑制宫颈癌发展[37].研究发现，下调lncRNA TDRG1可促进miR-326的表达，从而降低MAPK1的表达水平，抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭[38].c-Jun是由原癌基因JUN编码的一种转录因子相关蛋白，研究表明，c-Jun与肝癌、乳腺癌、结直肠癌等疾病的发生、发展和转移密切相关[39-40].P53是一种肿瘤抑制蛋白，可调节靶基因的表达，诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老，DNA修复或代谢等过程，TP53基因的突变普遍存在于各种癌症类型中[41-42].TNF是一种主要由巨噬细胞分泌的多功能促炎细胞因子，参与调控多种生物学过程，包括细胞增殖、分化、凋亡、脂质代谢和凝血等，并与自身免疫性疾病、胰岛素抵抗和癌症等疾病密切相关[43-44].

GO富集分析结果显示，靶点基因显著富集在药物反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正调控、转录正调控、衰老、细胞增殖正调控等生物学过程.三七总皂苷能一定程度透过血脑屏障进入脑内，调节帕金森患者脑中氨基酸质量浓度，发挥神经保护作用[45].三七乙醇提取物可通过介导胰岛素/IGF-1信号通路，增强应激抵抗，发挥抗衰老作用[46].白及多糖能有效抑制NADPH氧化酶4(NOX4)的上调，降低Ang Ⅱ诱导的toll样受体2(TLR2)过表达，发挥抗氧化应激和抗炎作用[47].此外，三七总皂苷通过启动PI3K/AKT/mTOR通路和PI3K/AKT/Bad通路促进肝再生期肝细胞增殖，保护肝细胞免受肝部分切除术后诱导的凋亡，可作为一种促进肝脏再生能力和肝脏功能恢复的新途径[48].KEGG的通路富集主要涉及癌症通路、乙型肝炎、膀胱癌、TNF信号通路、HIF-1信号通路等，其中，显著富集到癌症通路上的靶点基因有53个，与前述结果靶点基因与癌症相关的疾病数目最多结果相符，另外，癌症通路与mTOR信号通路、PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等多个信号通路的调控密切相关，说明癌症通路在三七-白及药对疾病治疗过程中的重要性.研究发现，三七总皂苷可显著降低Hgf,Met,Notch3等一系列促进肿瘤发生发展相关基因的表达，提高肿瘤抑制基因Rxrg的表达，调控Met/miR-222水平，发挥抗肺癌和其他类型癌症的作用[49].白及提取物可通过调控 PI3K/AKT 信号通路、RIG-1-like 信号通路、MAPK 信号通路、Toll 样信号通路以及 NF-κB信号通路中的差异基因表达，进而发挥抗流感病毒作用[50].体外实验发现，白及多糖可通过抑制肝细胞癌增殖，发挥抗肿瘤活性[51].目前研究已证实的三七和白及有效成分所涉及的生物学过程和信号通路，与文中研究预测结果存在一致性，说明预测结果的可靠性，表明三七-白及药对在疾病治疗，尤其是癌症的治疗过程中具有潜在的优势，可以作为未来进一步研究的方向.

综上所述，利用网络药理学方法综合分析三七和白及的活性成分、作用靶点、相关疾病和信号通路等，为深入研究三七-白及药对的药理作用机制提供理论依据，但具体结果仍需进一步的基础实验及临床研究验证.