巨噬细胞介导应激经由十二指肠炎症引发消化不良症状的机制研究*

李 青 邱宏毅 王 博 颜秀娟 程 莉 王倩倩 陈胜良

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科 上海市消化疾病研究所(200001)

背景：临床流行病学证据显示应激是消化不良症状的重要致病因素。十二指肠炎症是消化不良症状产生的关键机制之一，而巨噬细胞是参与炎症反应的关键因素。目的：确定合并精神心理应激因素的功能性消化不良(FD)患者的十二指肠炎症状态；通过避水应激(WAS)动物模型研究确认巨噬细胞是否参与介导了应激相关十二指肠炎症的发生。方法：观察并比较合并精神心理因素的FD患者和无症状健康体检者的十二指肠炎症特征。观察WAS小鼠模型(每日应激1 h，持续10 d)十二指肠炎症的动态变化，以及预先以氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞对十二指肠炎症的影响。采用HE染色和免疫细胞计数评估炎症严重程度，免疫组化染色检测巨噬细胞浸润情况，real-time PCR检测炎症因子表达。结果：与健康对照者相比，合并精神心理因素的FD患者十二指肠炎症更为严重[免疫细胞计数: (138.91±7.13)/HPF对(81.44±23.60)/HPF, P<0.000 1]，促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-17A表达升高，抗炎细胞因子IL-10、TGF-β表达降低(P均<0.05)。WAS小鼠模型的十二指肠炎症于应激第5天达到峰值，之后逐渐缓解；巨噬细胞浸润情况与炎症变化趋势一致。预先清除巨噬细胞的WAS小鼠模型，十二指肠炎症较单纯WAS小鼠显著减轻[免疫细胞计数: (75.10±4.08)/HPF对(202.43±5.18)/HPF, P<0.001]，促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-8表达降低，抗炎细胞因子IL-10表达升高(P均<0.05)。结论：应激相关消化不良症状可能是通过触发十二指肠炎症所引起，在应激引发十二指肠炎症的机制中，巨噬细胞可能发挥关键作用。

功能性胃肠病(functional gastrointestinal dis-orders, FGIDs)占消化内科门诊量的40%～70%，其中半数以上为胃-十二指肠功能紊乱性疾病，病因和发病机制复杂，缺乏有效的关键治疗靶点，是提升疗效的“瓶颈”。既往研究已确认十二指肠炎症(duodenal inflammation)是十二指肠-Oddi括约肌紊乱引发和加重胃-十二指肠承纳关系紊乱、胆汁反流、小肠消化吸收不良、小肠细菌过度生长(small intestinal bacterial overgrowth, SIBO)等一系列胃肠道功能性疾病的关键机制，可触发消化不良、胃食管反流等症状[1-3]。

临床流行病学证据显示精神心理应激是FGIDs的重要致病因素[3-4]，但应激是否与十二指肠炎症有关，以及应激引发十二指肠炎症的机制目前尚不明确。既往关于炎症反应过程的研究已确认：巨噬细胞焦亡(macrophage pyroptosis)现象是炎症发生、发展过程中的主导机制[5-6]。巨噬细胞介导的炎症反应在应激引发十二指肠炎症的机制中是否发挥主导作用，以及应激激活巨噬细胞的神经信号通路均有待阐明。本研究以合并精神心理因素的功能性消化不良(functional dyspepsia, FD)患者和避水应激(water avoidance stress, WAS)小鼠模型为研究对象，旨在确定合并精神心理应激因素的FD患者的十二指肠炎症状态，以及巨噬细胞是否参与介导了应激相关十二指肠炎症的发生。

材料与方法

一、临床资料

研究对象源自因消化不良症状于2019年1月1日—2020年1月1 日在上海交通大学医学院附属仁济医院消化内镜中心接受上消化道内镜检查者。纳入标准：①符合罗马Ⅳ FD诊断标准；②经询问存在焦虑(如失眠、经常为一件事情感到忧愁)和(或)抑郁(如早醒、开心不起来)表现，并通过相应精神心理量表确认。最终共23例合并精神心理因素的FD患者纳入研究；同期17名接受上消化道内镜检查的无症状健康体检者作为对照组。临床研究部分经医院伦理委员会审核批准，受试者均知情同意。

入组受试者评估内容包括人口学特征、利兹消化不良问卷(Leeds Dyspepsia Questionnaire, LDQ)、广泛性焦虑障碍量表GAD-7(Generalized Anxiety Disorder-7)和抑郁筛查量表PHQ-9(Patient Health Questionnaire-9)。内镜检查时取十二指肠黏膜活检2块，1块立即置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱内，用于real-time PCR检测；另1块于4%多聚甲醛溶液中固定，用于组织病理学检查。

二、实验动物分组和造模

健康雄性C57BL/6J小鼠90只，6～8周龄，体质量18～25 g，由上海交通大学实验动物中心提供。参照文献所述方法建立WAS小鼠模型[7]，每日应激1 h，持续10 d。模型小鼠每日称重，并于1 h应激过程中计数排便数目；另取10只小鼠不予应激，作为对照组。分别于应激第0(无应激)、1、3、5、8、10天各处死10只小鼠，获取十二指肠标本。其余20只小鼠进行巨噬细胞清除剂氯膦酸二钠脂质体(clodronate liposomes)预处理实验。20只小鼠随机分为四组：假应激(sham stress)+PBS脂质体组(SP组)、假应激+氯膦酸二钠脂质体组(SCl组)、WAS+PBS脂质体组(WP组)和WAS+氯膦酸二钠脂质体组(WCl组)，每组5只。预处理步骤为在应激前3 d予小鼠腹腔注射氯膦酸二钠脂质体(100 μL/10 g)；为防止骨中的单核巨噬细胞前体重新动员、分化为成熟巨噬细胞，于应激第3天重复注射一次，以保证巨噬细胞在整个应激过程中均处于清除状态。相应对照组于相同时间点腹腔注射PBS脂质体。氯磷酸二钠脂质体和对照PBS脂质体订购自LIPOSOMA BV(https://www.liposoma-technology. com/)。

三、十二指肠炎症病理学和分子生物学研究

1. HE染色和免疫细胞定量计数：十二指肠标本4%多聚甲醛溶液固定，脱水、透明、包埋、切片后行HE染色，光学显微镜下观察组织病理学变化。每张切片选取5个完全不重叠的高倍视野区域，计数浸润的免疫细胞(包括中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等)，结果取均值。

2. 巨噬细胞免疫组化染色：取十二指肠石蜡切片行巨噬细胞免疫组化染色，一抗为小鼠抗CD68单克隆抗体(1∶500; Abcam plc.)，过夜后加入兔抗小鼠IgG(1∶1 000; Abcam plc.)。免疫反应阳性细胞为黄褐色，每张切片选取5个完全不重叠的高倍视野区域，计数阳性细胞，结果取均值。

3. Real-time PCR检测十二指肠组织炎症因子表达：使用TRI试剂(Sigma-Aldrich)提取十二指肠组织总RNA，以PrimeScript RT Reagent Kit(Perfect Real Time; Takara Bio Inc.)逆转录为cDNA，以之为模板，使用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time; Takara Bio Inc.)，在StepOnePlus Real-Time PCR系统(Thermo Fisher Scientific)中行PCR扩增。人十二指肠组织以18S rRNA为内参基因，采用-ΔCt法计算mRNA相对表达量；小鼠十二指肠组织以GAPDH为内参基因，采用2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物序列

四、统计学分析

结 果

一、一般资料

23例FD患者中男性9例，女性14例；17名健康体检者中男性11名，女性6名。FD组体质指数(BMI)低于健康对照组，抑郁筛查量表PHQ-9评分高于健康对照组，两组间性别、年龄、焦虑情况差异无统计学意义(表2)。

表2 FD组与健康对照组一般资料比较

二、FD患者存在明显的十二指肠炎症

与健康对照组相比，FD组十二指肠组织免疫细胞浸润明显增多，差异有统计学意义(P<0.000 1；图1A)；促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-17A mRNA相对表达量明显升高，抗炎细胞因子IL-10、TGF-β mRNA和趋化因子CCL22 mRNA相对表达量明显降低，差异均有统计学意义(P<0.000 1,P<0.05,P<0.001,P<0.01,P<0.01,P<0.01；图1B)。上述结果表明，合并精神心理因素的FD患者存在明显的十二指肠炎症。

与健康对照(HC)组比较，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1

三、WAS引发小鼠十二指肠炎症

动物实验中，WAS小鼠模型体质量增长较慢(P<0.05)；在每日1 h的应激过程中，模型小鼠排便数目明显增加并于第5天达到峰值(P<0.000 1；图2A)。应激第0(无应激)、1、3、5、8、10天获取的十二指肠标本中，促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA相对表达量从第0天至第5天逐渐升高，之后逐渐降低；在整个应激过程中，抗炎细胞因子IL-10 mRNA相对表达量持续升高，于第10天达到峰值；趋化因子CCL5 mRNA相对表达量在应激第0天至第5天保持相对稳定，之后逐渐降低(图2B)。

两组间比较，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1

十二指肠组织HE染色和免疫细胞计数显示，WAS小鼠模型的十二指肠炎症从应激第0天至第5天逐渐加重(P<0.000 1)，之后逐渐缓解。此外，HE染色显示WAS引起的十二指肠炎症不只局限于黏膜层，黏膜下层和肌层也同时受累(图3)。

与0 d比较，**P<0.01, ****P<0.000 1

四、WAS诱导十二指肠巨噬细胞浸润

巨噬细胞免疫组化染色显示，与十二指肠炎症变化趋势一致，WAS小鼠模型应激过程中的十二指肠巨噬细胞浸润也呈现时间依赖性的动态变化，于应激第5天达到峰值(图4)。巨噬细胞主要浸润于十二指肠黏膜层，黏膜下层十二指肠腺周围也有少量巨噬细胞浸润，肌层则几乎无巨噬细胞浸润。由此推测，巨噬细胞可能在WAS引发的十二指肠炎症的发生、发展过程中发挥作用。

与0 d比较，*P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1

五、氯膦酸二钠脂质体能有效缓解WAS引起的十二指肠炎症

由于WAS小鼠模型十二指肠浸润的巨噬细胞数目于应激第5天达到峰值，且此时间点十二指肠炎症亦最为严重，因此选择5 d作为应激时长，使用巨噬细胞清除剂氯膦酸二钠脂质体耗竭小鼠体内的巨噬细胞。实验结果显示，氯膦酸二钠脂质体可有效清除浸润于十二指肠的巨噬细胞，SCl组和WCl组十二指肠区域几乎没有CD68阳性细胞浸润(图5A)。同时，HE染色和免疫细胞计数结果表明氯膦酸二钠脂质体能有效缓解WAS引起的十二指肠炎症(P<0.001；图5B)。WCl组小鼠排便数目亦较WP组明显减少(P<0.05；图5C)，从另一个角度反映了十二指肠炎症程度的减轻。

Real-time PCR检测结果与组织病理学结果一致，WCl组小鼠十二指肠组织促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-8 mRNA和趋化因子CCL5 mRNA相对表达量较WP组明显降低(P<0.001,P<0.000 1,P<0.05,P<0.05)，抗炎细胞因子IL-10 mRNA相对表达量明显升高(P<0.05)，差异均有统计学意义(图5D)。

两组间比较，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1

讨 论

FD被认为是在多种因素的作用下，由若干调控机制紊乱参与形成的胃-十二指肠功能障碍性疾病。目前较为清楚的发病机制包括胃-十二指肠运动紊乱、区域内脏高敏感性、黏膜低度炎症等。精神心理应激、脑-肠互动均已被证实与FD的病理生理学过程密切相关[8]。在生活节奏日益加快的现代社会，精神心理应激已成为FD发病的主要原因之一。研究证实FD患者的十二指肠区域存在黏膜屏障功能受损、免疫激活和黏膜低度炎症[9-13]。本研究探讨了精神心理应激因素在FD十二指肠炎症中的作用及其可能的发生机制。研究结果显示，合并精神心理因素的FD患者存在明显的十二指肠炎症，提示FD症状确与十二指肠炎症有关，而精神心理应激可能是十二指肠炎症的重要诱发因素。进一步的WAS小鼠模型研究结果证实了这一推测，WAS确实可引发明显的十二指肠炎症。

慢性应激状态下，下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感-肾上腺髓质系统过度激活，导致血液中的糖皮质激素和儿茶酚胺如肾上腺素、去甲肾上腺素水平升高。这些激素可能与胃肠道黏膜免疫炎症细胞上的相应受体结合，触发炎症细胞免疫应答，从而引发十二指肠炎症。Vanheel等[11]应用透射电子显微镜对FD患者的十二指肠活检标本进行评估，发现其嗜酸性粒细胞脱颗粒程度显著高于健康对照者。另有研究证实，在FGIDs、食物过敏等情况下，肥大细胞激活可导致上皮和神经肌肉功能障碍，引发内脏高敏感，改变胃肠运动功能[12]。胃肠道是人体中最大的巨噬细胞池，巨噬细胞在肠道免疫稳态的维持中起至关重要的作用[14]。作为固有免疫的重要组成部分，巨噬细胞是否参与了应激相关十二指肠炎症的发生机制值得进一步探究。

本研究对WAS小鼠模型的观察发现，WAS引起的十二指肠炎症呈现时间依赖性的动态变化，应激第0天至第5天炎症逐渐加重，于第5天达到峰值后逐渐缓解，十二指肠区域浸润巨噬细胞的动态变化与炎症变化情况相一致。作为一种新发现的细胞程序性死亡形式，细胞焦亡(又称炎性死亡)在巨噬细胞促炎机制中的重要作用近年来备受关注[5-6]。本研究发现，使用巨噬细胞清除剂氯膦酸二钠脂质体预先清除巨噬细胞能有效缓解WAS小鼠模型的十二指肠炎症，表明巨噬细胞参与了应激引发十二指肠炎症的过程，而巨噬细胞焦亡现象可能是此过程的主导机制。Wehner等[15]的研究结果亦证实了巨噬细胞在肠道炎症反应中的作用，利用氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞后，小肠切除术后大鼠的肠道炎症明显减轻。

综上所述，本研究发现应激相关消化不良症状可能是通过触发十二指肠炎症所引起，在应激引发十二指肠炎症的机制中，巨噬细胞可能发挥关键作用。本研究是对巨噬细胞参与介导应激相关十二指肠炎症的初步探讨，未能进一步阐明应激诱导巨噬细胞激活介导炎症发生、发展的分子信号通路，这是本研究理论贡献中最突出的局限性。探索精神心理应激因素引发巨噬细胞功能改变甚至巨噬细胞焦亡的分子信号通路，进而找寻相关机制中有可干预意义的靶点，将是后续深入研究的方向。