长链非编码RNA对结直肠癌预后的价值*

周晓瑞 汪浩洋 朱秋民 张 炜

江苏大学附属医院消化科(212001)

背景：近年长链非编码RNA(lncRNA)被视为新的肿瘤生物学标志物，但其在结直肠癌发生、发展机制中的研究较为有限。目的：探讨lncRNA变化与结直肠癌患者临床病理特征和预后的相关性。方法：Cox分析筛选出与TCGA数据集结直肠癌患者预后相关的lncRNA，并分析目的lncRNA与临床病理特征的相关性。构建稳定低表达LINC00327的结直肠癌细胞株，以实时定量PCR法检测基因表达，CCK-8法检测细胞增殖情况，Transwell实验检测细胞侵袭情况。结果：共94个lncRNA改变频率为5%～31%。发生mRNA表达变化的7个lncRNA(DSCR4A、DSCR8、FAM138F、LINC00161、LINC00303、LINC00313、LINC00315)与总体生存率低密切相关；6个发生拷贝数改变(CNA)的lncRNA(LINC00327、LINC00352、LINC00362、LINC00424、LINC00566、LINC00621)与肿瘤复发密切相关。上述mRNA表达变化与结直肠癌患者年龄和淋巴结转移显著相关；CNA与肿瘤临床分期和血管浸润显著相关。LINC00327下调可抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。结论：与结直肠癌患者预后和临床病理特征密切相关的lncRNA或许可用于结直肠癌的早期诊断、预测发展以及预后分析。LINC00327可能为潜在的致癌基因。

结直肠癌是全球确诊患者例数第三高的肿瘤，我国结直肠癌发病率有上升的趋势，且患者预后高度依赖个人吸烟史、运动习惯、饮食结构、用药情况等。早期结直肠癌几乎没有特异性症状，加上缺乏早期诊断标志物，导致大多数结直肠癌患者错过早期就诊的机会，预后较差[1-2]。尽早明确结直肠癌预后的生物学标志物对改善预后具有重要意义。

近年越来越多的研究证实长链非编码RNA(lncRNA)具有重要的生物学效应[3]。研究表明非编码RNA在正常组织稳态和病理生理条件的调节中起有重要作用，尤其是lncRNA可影响染色质结构、基因转录、编码RNA加工和不同阶段的信号通路[4-5]。但目前对lncRNA的了解有限[6-7]。本研究通过筛选出与结直肠癌患者总体生存率(OS)或无病生存率(DFS)密切相关的lncRNA，分析其与患者临床病理特征的相关性，并探讨LINC00327下调后结直肠癌细胞增殖、侵袭的变化，从而证实lncRNA对结直肠癌诊断和治疗的价值。

材料与方法

一、数据库搜索

cBioPortal(www.cbioportal.org)目前提供TCGA中293项肿瘤研究的116 025个肿瘤病例样本[8]，其中包含八组结直肠癌样本数据集。选择样本容量为629例患者的数据集进行研究。将来自HGNC(http://www.genenames.org)的共计4 790个lncRNA(更新至2020-10-20)逐一代入cBioPortal，以GISTIC突变、拷贝数改变(CNA)、mRNA表达、蛋白质和磷酸蛋白丰度四种lncRNA变化方式作为参数，查询lncRNA在各参数下的变化情况，再通过GraphPad Prism 8绘制生存曲线，从而得到lncRNA的改变频率以及发生lncRNA变化的患者的OS或DFS的P值。

二、主要实验方法

1. 细胞培养：结直肠癌细胞株SW480购自ATCC，293T细胞株购自汉恒生物科技(上海)有限公司。SW480细胞培养于RPMI-1640培养基，293T细胞培养于DMEM培养基。培养基均包含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。细胞培养条件为5% CO2，温度为37 ℃。

2. 慢病毒感染：构建三质粒(REV、GAG、VAVG)慢病毒系统，包装CRISPR/Cpf1-LINC00327质粒后，使其感染293T细胞获取病毒液。通过病毒液感染SW480细胞，构建稳定低表达LINC00327的结直肠癌细胞株(LINC00327-1、LINC00327-2)。感染SW480细胞后培养24 h，更换为含10% FBS的完全培养基进行培养。

3. 实时定量PCR(qPCR)：RNA提取试剂盒(上海超研生物科技有限公司)提取总RNA，逆转录合成cDNA(试剂购自南京诺维赞生物科技股份有限公司)，行实时定量PCR。LINC00327引物序列正义链：5’-CCT GTC AGG CTA GGT TCA CA-3’，反义链：5’-GCC AAG GAA GCA GAT ACA CG-3’；以GAPDH作为内参，引物序列正义链：5’-GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3’，反义链：5’-GTG AGG GTC TCT CTC TTC CT-3’。应用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验至少重复三次。

4. CCK-8法：将细胞以体积100 μL/孔接种到96孔板，密度为5 000个细胞/孔。孵育4 h后加入10 μL CCK-8试剂(南京诺维赞生物科技股份有限公司)后继续37 ℃孵育2 h，培养24 h、48 h和72 h时应用酶标仪测量450 nm波长处的吸光度值。实验至少进行三次。

5. 侵袭实验：以密度为10 000个细胞/室添加到上部小室(侵袭小室购自美国Costar公司)，上部小室的培养基不含FBS，下部小室培养基含10% FBS。37 ℃孵育24 h后，用棉签擦拭过滤器上层细胞，冷甲醇固定，0.1%结晶紫染色30 min。显微镜下随机选择多个区域进行细胞计数和拍照。

三、统计学分析

结 果

一、LncRNA搜索结果

在cBioPortal数据集中逐一搜索来自HGNC数据库的4 790个lncRNA，共识别出4 175个有效lncRNA。94个lncRNA改变频率为5%～31%，包括CNA、mRNA表达变化。

二、LncRNA mRNA改变与患者OS密切相关

54个lncRNA mRNA表达改变频率≥5%。Cox模型分析结果显示，7个lncRNA与OS密切相关，即DSCR4A、DSCR8、FAM138F、LINC00161、LINC00303、LINC00313、LINC00315(图1A)。上述mRNA表达的总变异率为30%，mRNA发生改变者较未发生改变者的预后更差(P<0.01)(图1A)。LncRNA mRNA表达改变包括上调和下调(图1B)，推测正常表达时不具有促癌作用。以GISTIC突变、CNA、mRNA表达以及蛋白质丰度和磷酸蛋白丰度作为研究参数时，上述7个lncRNA mRNA变化与DFS无明显相关性。

此外，DSCR4A、DSCR8、LINC00161、LINC00313、LINC00315集中于21号染色体上，分布较为密集，最小间距仅为91 bp。

三、LncRNA CNA与肿瘤复发密切相关

44个lncRNA的CNA频率≥5%。Cox模型分析结果显示，6个lncRNA为预测复发的最佳集合，即LINC00327、LINC00352、LINC00362、LINC00424、LINC00566、LINC00621(图2A)。CNA的总变异频率为6%，与肿瘤复发显著相关(P<0.05)，且大部分改变是由于基因扩增(图2B)。当CNA作为唯一参数时，6个lncRNA与OS无明显相关。

A：6种与患者DFS相关的lncRNA的生存曲线；B：6种lncRNA CNA的变化频率

此外，6个lncRNA均位于13号染色体长臂，除LINC00424位于13q12.11外，其余均位于13q12.12。

四、LncRNA变化与临床病理特征的关系

选取629例患者的临床病理特征，根据7个lncRNA mRNA表达是否发生变化，将患者分为mRNA变化组和对照组。结果显示lncRNA mRNA表达变化与结直肠癌患者的年龄(P=0.004)和淋巴结转移(P=0.004)密切相关(表1)。

表1 结直肠癌中mRNA表达变化与临床病理特征的关系

根据6个lncRNA CNA变化，将患者分为CNA扩增组和未扩增组。结果显示6个lncRNA CNA的扩增与结直肠癌的临床分期(P=0.02)和血管浸润(P=0.04)相关(表2)。

表2 结直肠癌中CNA与临床病理特征的关系

五、LINC00327是一个潜在的致癌基因

以含有CRISPR/Cpf1质粒的慢病毒下调结直肠癌SW480细胞中LINC00327表达，以qPCR法挑选出LINC00327表达明显下调的两个单克隆细胞株(LINC00327-1、LINC00327-2)作为实验组，将未进行处理的SW480细胞作为对照组。CCK-8和Transwell实验结果显示，LINC00327下调后结直肠癌细胞增殖、侵袭能力明显下降(P<0.05；图3)。说明LINC00327可促进肿瘤细胞增殖和侵袭，可能为潜在的致癌基因。

A：成功构建LINC00327下调的SW480细胞株(LINC00327-1、LINC00327-2)；B：细胞增殖情况(CCK-8法)；C：细胞侵袭能力(Transwell实验)

讨 论

相较胰腺癌、胃癌等其他肿瘤而言，lncRNA在结直肠癌发生、发展机制中的研究较为有限。本研究通过生物信息学分析发现13个与结直肠癌患者预后具有相关性的lncRNA，并以LINC00327为代表验证对结直肠癌细胞生长、增殖的影响，考虑可能为潜在的致癌基因。

目前用于结直肠癌诊断的常见血清学标志物有癌胚抗原(CEA)、糖类抗原19-9(CA19-9)、CA12-5和血清p53抗体[9-11]，但胰腺癌、肺纤维化、肝硬化、肝癌均可能导致血清CA19-9升高[12]，高水平CEA也常见于肺癌等恶性疾病[13]，CA12-5为诊断和监测卵巢癌的生物学标志物[14]，血清p53抗体升高也可见于乳腺癌[15]。因此，上述肿瘤标志物对结直肠癌的诊断缺乏特异性。目前组织病理学检查为临床诊断癌症的“金标准”，但该方法不仅是有创操作，更重要的是用于活检的组织未必能准确反映肿瘤组织异质性[16]。液体活检是指对液体中肿瘤来源的蛋白质、游离DNA以及编码RNA等进行定量、定性分析的新兴诊断方法[17]。LncRNA在染色质重塑、转录控制和转录后水平上调节临近编码基因表达，从而影响肿瘤细胞的生物学行为，具体表现为其通过募集染色质重塑复合体到特定的基因组位点来修饰染色质，实现表观遗传的变化[18]；通过增强子和启动子转录后实现转录调控[19]；通过剪接、编辑、运输、翻译和降解实现转录后处理[20]。LncRNA可在细胞凋亡和坏死后通过凋亡小体或细胞外囊泡从细胞中分泌至循环系统并与蛋白质结合[21]，其既具有器官和细胞特异性又可在体液中检测到，甚至有研究表明肺癌患者痰液中发现可作为肿瘤生物学标志物的lncRNA[22]；膀胱恶性肿瘤患者尿液中可检测到与预后不良有关的lncRNA表达谱[23]。较之肿瘤标志物、组织活检、液体活检的局限性，经筛选获得的可作为肿瘤生物学标志物的lncRNA具有数目庞大、易于获得、较高的组织、器官特异性等优势，或许可将液体检测范围扩大到lncRNA，以补充完善结直肠癌的肿瘤标志物，甚至作为独立生物学标志物。本研究结果显示，mRNA表达发生变化的7个lncRNA(DSCR4A、DSCR8、FAM138F、LINC00161、LINC00303、LINC00313、LINC00315)与OS低密切相关；而6个发生CNA的lncRNA(LINC00327、LINC00352、LINC00362、LINC00424、LINC00566、LINC00621)与肿瘤复发密切相关。6个lncRNA均位于13号染色体长臂上，13号染色体长臂已被确定为密切的肿瘤相关区域，如胃肠间质瘤的进展与13号染色体长臂丧失有关[24]；多发性骨髓瘤与13号染色体长臂染色体的完全或部分缺失密切相关[25]。抑癌基因RB在细胞周期中起重要的负向调控作用，可明显抑制肿瘤的发展，其位于13q14.2号染色体[26]。为确定这些lncRNA是否与RB密切相关，本研究发现离抑癌基因RB越远的基因的CNA越小，推测该组lncRNA CNA与肿瘤发生呈正相关，且作用与RB表达产物相反。

尽管上述lncRNA在结直肠癌中的作用仍有待确定，但其与癌症死亡或复发的关系可能表明其发挥了致癌作用。与患者OS密切相关的生物学标志物是由mRNA发生改变的lncRNA组成的，其变化包括mRNA上调和下调，推测正常表达的mRNA不具有肿瘤驱动的作用。与肿瘤复发密切相关的生物学标志物是由发生CNA的lncRNA组成，推测其基因扩增与肿瘤发生呈正相关。本研究通过实验证实CNA改变频率最高的LINC00327上调可能发挥致癌的作用，LINC00327下调可抑制肿瘤细胞增殖和侵袭。

总之，本研究通过生物信息学筛选结合体外实验的方法，证实LINC00327可能为结直肠癌的肿瘤标志物，后续可进一步通过结合测序和生物信息学方法揭示LINC00327对临近编码基因进行调控的具体机制[27-28]，以及LINC00327所在的LINC00327-mRNA/miRNA相互作用网的具体作用。