两种牧草在青贮过程中氮转化动力学的比较

吉国强,刘瑞霞,杜秀娟

(山西林业职业技术学院,山西太原 030009)

青贮是牧草收获后保存的常用方法，但由于青贮过程中蛋白质发生水解，从而降低了蛋白质的品质。对于一些青贮饲料（如紫花苜蓿），蛋白水解损失可能特别高，其蛋白降解率为饲料蛋白的44% ～87%（马春晖等，2010）。饲料蛋白可转化为非蛋白氮（氨、氨基酸和小肽），反刍动物对其利用不高，不仅给养殖者造成巨大的经济损失，而且给环境造成巨大的氮负担。不同的因素会影响蛋白水解的速率和程度，其中pH 的下降速度在降低蛋白降解速率中起关键作用。同时，其他因素（如饲料品种）也可能影响牧草青贮过程蛋白质水解的程度。与紫花苜蓿相比，红花苜蓿的蛋白质水解程度较低，只有7% ～40% 的蛋白质在青贮过程中被降解，导致这种差异的主要因素与红花苜蓿中天然蛋白保护机制的存在有关，即多酚氧化酶的活性可以催化内源酚类物质氧化为醌类物质，这些醌与细胞蛋白上的亲核位点发生反应，形成蛋白- 酚复合物，以抵抗蛋白水解或灭活蛋白酶（Van Ranst 和 Lee，2011）。但虽然多酚氧化酶可以降低蛋白质的水解，但还不清楚紫花苜蓿和红花苜蓿青贮过程氮组分的变化情况。此外，有研究表明，红花苜蓿蛋白质水解的降低是由于多酚氧化酶使植物蛋白酶失活的结果（Lee，2014）。牧草蛋白质在青贮过程中的降解是一个涉及植物和微生物蛋白酶的过程，而多酚氧化酶的存在是否会影响微生物的活性目前尚不清楚。放射处理是一种常用来区分微生物活性作用和植物酶作用的方法。许多研究表明，放射处理能有效杀菌，但对植物酶的影响很小（Ding 等，2013）。本研究旨在研究紫花苜蓿和红花苜蓿青贮过程氮的动力学特征，以及放射处理这两种牧草后对氮和微生物活性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验设计与原料青贮 分别将750 g 切碎的紫花苜蓿和红花苜蓿装入1 L 的带盖筒仓中，称重后用塑料盖和胶带封好。将含有紫花苜蓿和红花苜蓿的筒仓分为两组，一组由γ- 射线在室温下放射处理2 h。根据Ding 等（2013）研究发现，这种方法放射处理能有效抑制青贮牧草中的微生物活性。因此，本试验分为4 个处理组：未经放射的紫花苜蓿青贮饲料、放射处理的紫花苜蓿青贮饲料、未放射的红花苜蓿青贮饲料和放射处理的红花苜蓿青贮饲料。这些筒仓储存在18 ～22℃下，每个处理由16 个筒仓组成，并在青贮1、4、8 和30 d 后打开筒仓。在筒仓开启时将其转移到一个塑料箱中均匀混合，然后采集样品进行化学和微生物分析。

1.2 化学及微生物分析 将约0.5 kg 新鲜饲料和青贮饲料样品在60℃下烘干48 h，以测定干物质含量。干燥后的样品经粉碎后过1 mm 分析筛，用于总氮分析。在70 mL 去离子水中加入30 g新鲜牧草和青贮饲料，4℃下提取24 h，得到冷提取液，按照Chen 等（2015）的方法测定青贮饲料的发酵参数。水提取液用pH 计测定pH。采用高效液相色谱法测定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和乙醇的含量。将10 L 25% 三氯乙酸溶液加入到40 mL 提取液中，室温静置1 h，使蛋白质沉淀，4℃、18000×g 离心15 min，上清液分别检测氨氮、游离氨基酸氮、肽氮和非蛋白氮（Licitra 等，1996）。

取0.5 kg 的放射处理后的枯萎牧草，测定微生物（乳酸菌、酵母菌和好氧菌）数量。参考Winters 等（2008）的方法分析多酚氧化酶活性。

1.3 统计分析 所有试验数据均采用SAS 软件进行MIXpro 程序分析。发酵参数、氮组分数据采用以下模型 ：Yijk=μ+ Si + Aj + Tk + Si×Aj + Si×Tk +Aj Si××Tk + Aj×Tk +ɛ，其中 Si 为青贮时间，Aj 为固定效应（牧草品质），Tk 为固定效应（放射处理）。在同一模型中测试了这些效应之间的相互作用。采用Tukey 法进行多重比较，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 两种牧草化学成分 由表1 可知，两种牧草的化学成分无显著差异（P＞0.05）。

表1 紫花苜蓿和红花苜蓿的营养成分

2.2 多酚氧化酶和微生物组成 由表2 可知，在紫花苜蓿中没有检测到多酚氧化酶活性，而在红花苜蓿中多酚氧化酶活性较高，达到15.6 U/g。放射处理对红花苜蓿多酚氧化酶活性无显著影响（P＞0.05），其中放射处理组红花苜蓿多酚氧化酶活性达到14.1 U/g。放射处理显著降低了牧草乳酸菌、酵母菌和好氧菌数量（P＜0.05）。

表2 放射处理对牧草多酚氧化酶和微生物组成的影响

2.3 牧草发酵参数 由表3 可知，牧草放射后青贮的发酵参数与非放射青贮的发酵参数不同。其中，放射组牧草青贮饲料的pH 显著高于对照组（P＜0.05），发酵终产物（乳酸、乙酸和乙醇）无显著差异（P＞0.05）。相比之下，未放射的青贮料在整个发酵过程中发酵强度更强，pH 下降幅度更大，发酵终产物积累量更多。

表3 放射处理对牧草发酵参数的影响

2.4 氮成分 由表4 可知，紫花苜蓿青贮饲料中肽氮含量显著高于红花苜蓿（P＜0.05）。在第1 天放射处理后显著提高了青贮紫花苜蓿肽氮含量（P＜0.05）。与肽氮相似，在紫花苜蓿青贮的第1 天前，与红花苜蓿青贮相比，氨基酸氮的增加更大（P＜ 0.05）。第 4 ～ 30 天，放射组较对照组显著降低了两种青贮牧草的氨基酸氮水平（P＜0.05）。与紫花苜蓿青贮相比，红花苜蓿在整个青贮过程中氨氮含量均较低（P＜0.05）。放射降低了两种青贮牧草的氨氮水平（P＜0.05）。试验结束时，紫花苜蓿和红化苜蓿的非蛋白氮浓度分别提高了5.50 倍和4.85 倍，非蛋白氮增长最快的是第1 天。

表4 放射处理对牧草氮成分的影响

3 讨论

3.1 γ- 射线放射处理牧草对微生物活性的影响 为了分离植物和微生物活动对青贮牧草中氮成分的影响，本研究利用放射处理来达到这种目的。有些细菌（如梭状芽孢杆菌的芽孢）对放射处理有很强的抗性，如果剂量适当，对植物酶没有或只有轻微的损伤（Merry 等，1995）。在本试验中，无论放射处理与否，两种青贮牧草中均未检出丁酸（数据未列出），这可能是由于新鲜牧草中梭状芽孢杆菌的数量较少。放射处理后对红花苜蓿多酚氧化酶活性无显著影响，这在一定程度上反映了放射处理对植物酶活性无显著影响。总的来说，γ- 射线放射处理有效抑制了微生物的活动，但对植物酶活性影响不大。

3.2 青贮牧草的氮动力学变化 植物蛋白在青贮过程中的降解是不可避免的，会导致真蛋白转化为营养价值较低的非蛋白氮。蛋白质转化过程涉及两个已知的步骤：首先是肽键水解，形成游离氨基酸和肽。其次，氨基酸被进一步分解成氨、有机酸和胺，其中植物蛋白酶主要负责将真蛋白转化为游离氨基酸和多肽，而进一步的氨基酸代谢是微生物蛋白酶的产物（Henderson 等，1982）。作为水解的直接指示物，多肽是通过蛋白质水解形成的，并通过微生物的脱氨和脱羧作用进一步降解。与青贮紫花苜蓿相比，无论放射处理与否，红花苜蓿在青贮初期的肽氮含量较低，说明蛋白水解作用较少。作者认为，这种较低的蛋白质分解可能是由于多酚氧化酶的作用使植物蛋白酶失活所致。此外，蛋白质- 酚结合降低了蛋白质的溶解度，降低了青贮过程中蛋白质的分解（Hart等，2016）。但放射处理红花苜蓿青贮后未观察到肽氮的增加，这可能是由于植物蛋白酶活性低，即使在良好的青贮条件下也不能引起更大程度的蛋白质水解。

由于肽和游离氨基酸都是真蛋白的水解产物，二者在青贮过程中的动力学关系密切。与肽类似，微生物可消耗游离氨基酸作为脱氨生成氨气的底物，其含量在很大程度上取决水解和脱氨之间的相对活性。与放射处理组相比，对照组紫花苜蓿和红花苜蓿青贮在第4 和30 天表现出更高的游离氨基酸氮。在青贮后期，微生物蛋白酶活性逐渐取代了植物蛋白酶的主导活性，导致更多的游离氨基酸氮产生。作为氨基酸进一步的分解产物，氨是由微生物活动而不是由植物酶产生的（Guo 等，2007）。本研究发现，在整个青贮过程中，青贮红花苜蓿比紫花苜蓿的氨含量低，这可能是因为红花苜蓿的弱蛋白水解导致用于微生物脱氨的游离氨基酸底物更少。由于放射处理抑制了微生物活动，其氨含量也较低。无论哪种牧草，非蛋白氮在青贮第1 天的增长速度最快，说明大部分蛋白质的分解发生在青贮的第1 天，这与Guo等（2007）的研究结果一致。在青贮结束时，非放射处理组牧草青贮后较对照组非蛋白氮浓度的微小差异揭示了微生物蛋白酶在青贮过程中是从属作用（Ding 等 2013）。

4 结论

本研究反映了放射处理对豆科物种青贮过程微生物活性的影响，紫花苜蓿和红花苜蓿的氮转化模式不同，特别是在青贮期，与紫花苜蓿相比，红花苜蓿多酚氧化酶的存在对微生物活性有一定影响，但受多酚氧化酶影响较小。