基于网络药理学研究加味桃核承气汤治疗2型糖尿病的作用机制❋

彭陈文，黄 璇，孙茗威，张家振，甄伟龙，王 森，文彦钧，张 韧，黄雅丽△

(1. 广州中医药大学第一临床医学院，广州 510405； 2. 广州中医药大学基础医学院， 广州 510006)

目前，糖尿病已成为威胁人类健康最重要的疾病之一。最新流行病学调查显示，2015年全球糖尿病患者已有4.15亿，其中发展中国家患者占据75%，预计2040年全球糖尿病患者数量将达到6.42亿[1]。中国糖尿病的流行情况更为显著，患病率高达11.6%，糖尿病患者总数达1.13亿[2]。2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的临床病理改变是以胰岛素分泌相对不足和胰岛素抵抗为主。T2DM会给各种脏器造成长期损害，尤其是眼、肾、神经以及心血管进而严重影响患者的生命质量[3-4]。

T2DM属于中医学“消渴”范畴，广州中医药大学熊曼琪教授认为，T2DM的基本病机为瘀热互结、气阴两虚。据此，在具有泻热逐瘀功效桃核承气汤基础上，开创出加味桃核承气汤(Jiawei Taohe Chengqi Decoction,JTCD)用于T2DM的临床治疗，取得了良好疗效[5]。目前，JTCD治疗T2DM的作用机制尚未得到系统阐释。因此，研究JTCD治疗T2DM多成分、多靶点、多通路的作用机制，对T2DM中医药治疗具有非常重要的意义。

本研究将应用网络药理学分析，系统地揭示JTCD治疗T2DM的潜在作用机制，为其临床应用提供理论依据，并且为中医药经典名方药理机制的研究提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 JTCD化学成分的获取与筛选

通过TCMSP数据库(http:∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分别收集桃仁、芒硝、大黄、桂枝、玄参、生地黄、麦冬、黄芪、甘草化学成分，采用OB(Oral bioavailability)≥30%、DL(Drug-likeness)≥0.18对收集到的成分进行筛选。

1.2 JTCD化学成分的靶点预测

通过PubChem 数据库(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，获取化合物的标准Canonical SMILES 格式，将SMILES 格式文件输入SwissTargetPrediction平台(http:∥www.swisstargetprediction.ch/)，设置属性为“homo sapiens”，预测化合物的潜在靶点。该平台设有参数“可能性”(Probability)评估预测靶点的准确性。为提高所得靶点的准确性，本文选取可能性大于0.5(最高值为1)的预测靶点。若某一化合物的预测靶点可能性均小于0.5，则选取可能性排列前5的靶点，至少保证每一化合物获得5个预测靶点。

1.3 JTCD治疗T2DM的相关作用靶点收集

以关键词“type 2 diabetes mellitus”，通过TTD(http:∥bidd.nus.edu.sg/BIDDDatabases/TTD/TTD.asp)、OMIM (http:∥www.omim.org/)、DiGSeE (http:∥210.107.182.61/geneSearch/)、Drug Bank(https:∥www.drugbank.ca/)及Human Phenotype Ontology(HPO、https:∥hpo.jax.org/app/)5个疾病靶点数据库，收集T2DM的相关疾病靶点基因，去除重复基因，与上一步得到的靶点进行比对，最后获得JTCD治疗T2DM的潜在作用靶点。

1.4 JTCD治疗T2DM的靶蛋白相互作用网络构建

使用Sring数据库(https:∥string-db.org/)检索JTCD治疗T2DM潜在靶标的蛋白相互作用数据，物种设为“Homo sapiens”(人类)，最低相互作用阈值设为中等置信度“medium confidence”0.4，其余参数保持默认设置，获取靶蛋白相互作用数据，使用Cytoscape3.2.1软件绘制靶蛋白相互作用(PPI)网络。

1.5 作用靶点的KEGG通路分析

将JTCD治疗T2DM的45个作用靶点导入Metascape 平台[6]，输入物种和分析物种均选择“H.sapiens”，设置P value<0.01，对输入靶点进行KEGG分析并保存结果，根据每个条目的P value从小至大进行排序，筛选前15条目，通过OmicShare网站(http:∥www.omicshare.com/)对结果进行可视化。

1.6 JTCD治疗T2DM “成分-靶点-通路”网络构建

将JTCD治疗T2DM的作用靶点和代谢通路数据输入Cytoscape3.2.1软件，构建“成分-靶点-通路”网络。

2 结果

2.1 JTCD化学成分的筛选

表1示，根据OB>30%、DL>0.18，筛选出95个主要活性成分。其中桃仁13个，包括香豆酰奎宁酸、α1-抗谷甾醇7等；大黄10个，包括芦荟大黄素、叶黄素等；桂枝4个，包括表儿茶素、β谷甾醇等；生地黄2个，包括β-谷甾醇、豆甾醇；玄参3个，包括β谷甾醇、柳杉酚；黄芪18个，包括常春藤、槲皮素等；麦冬2个，包括多孔甾醇、N-对香豆酰酪胺；甘草72个，包括桦木酸、毛蕊异黄酮等；TCMSP数据库无芒硝化学成分。

表1 JTCD化学成分基本信息比较

HerbsNo.Molecule NameOB/%DLM38Formononetin69.67 0.21 M40Calycosin47.75 0.24 M41Kaempferol41.88 0.24 M47(-)-Medicarpin-3-O-glucoside40.99 0.95 M481-Methoxyphaseollidin69.98 0.64 M493-(2,4-Dihydroxyphenyl)-5-methoxy-7-hydroxycoumarin83.71 0.27 M503,3'-DI-O-Methylquercetin46.45 0.33 M513'-Hydroxy-4'-O-Methylglabridin43.71 0.57 M523'-Methoxyglabridin46.16 0.57 M535-Prenylbutein46.27 0.31 M549-Eicosenoic acid30.70 0.20 M55AC1LCTJ160.25 0.63 M56AC1LIUG442.56 0.20 M57AC1NSWUJ39.71 0.33 M58Euchrenone A730.29 0.57 M59Eurycarpin A43.28 0.37 M60Gancaonin A51.08 0.40 M61Gancaonin B48.79 0.45 M62Gancaonin G60.44 0.39 M63Gancaonin H50.10 0.78 M64Glabranin52.90 0.31 M65Glabrene46.27 0.44 M66Glabridin53.25 0.47 M67Glabrone52.51 0.50 M68Glepidotin A44.72 0.35 M69Glepidotin B64.46 0.34 M70Glyasperin B65.22 0.44 M71Glyasperin C45.56 0.40 M72Glyasperin F75.84 0.54 M73Glycyrol90.78 0.67 M74Glycyroside37.25 0.79 M75Glycyrrhiza flavonol A41.28 0.60 M76Glypallichalcone61.60 0.19 M77Glyuranolide34.32 0.55 M78Glyzaglabrin61.07 0.35 M79Icos-5-enoic acid30.70 0.20 M80Isoformononetin38.37 0.21 M81Isoglycyrol44.70 0.84 M82Isolicoflavonol45.17 0.42 M83Isotrifoliol31.94 0.42 M84Jaranol50.83 0.29 M85Kanzonol B39.62 0.35 M86Kanzonol F32.47 0.89 M87Licoagrocarpin58.81 0.58 M88Licoagroisoflavone57.28 0.49 M89Licochalcone A40.79 0.29 M90Licochalcone B76.76 0.19 M91Licochalcone G49.25 0.32 M92Licocoumarone33.21 0.36 M93Licoisoflavone A41.61 0.42 M94Licoisoflavone B38.93 0.55 M95Licorice glycoside E32.89 0.27 M96Licoricone63.58 0.47 M97Liquiritigenin32.76 0.18 M98Liquiritin65.69 0.74 M99Lupiwighteone51.64 0.37

HerbsNo.Molecule NameOB/%DLM100Maackiain75.18 0.54 M101Medicarpin49.22 0.34 M102Naringenin59.29 0.21 M103Odoratin49.95 0.30 M104Phaseol78.77 0.58 M105Phaseollinisoflavan32.01 0.45 M106Semilicoisoflavone B48.78 0.55 M107Shinflavanone31.79 0.72 M108Shinpterocarpin80.30 0.73 M109Sigmoidin-B34.88 0.41 M110Vestitol74.66 0.21 M111Xambioona54.85 0.87

2.2 靶点预测

表2示，通过SwissTargetPrediction 平台，基于参数“可能性”预测JTCD化合物的潜在靶点，共获得1138个基因靶点，删除重复项，共得到232个潜在靶点，并且将这些靶点和通过OMIM、 TTD、DiGSeE、Drug Bank以及HPO疾病数据库搜集到的T2DM相关基因进行比对，得到JTCD成分潜在靶点与疾病靶点的交集，最终获得45个可能与JTCD治疗T2DM相关的靶点。

表2 JTCD治疗T2DM的45个潜在作用靶点

2.3 靶蛋白PPI网络分析

图1示，将JTCD治疗T2DM相关的45个靶蛋白导入String数据库获取相互作用关系，使用Cytoscape3.2.1 绘制靶蛋白 PPI 网络图(图中英文缩写为靶基因名称，如AR表示雄激素受体)。

图1 网络药理学探究JTCD治疗T2DM技术路线

图2示，此网络共包括 40个节点208个边(若两蛋白以边相连，则表明两蛋白间存在相互作用关系)，图中 degree值越大则节点越大，结果提示TCT治疗T2DM靶点中Degree值排名前 5的靶蛋白为AKT1、SRC、EGFR、CASP3、NOS3。

图2 JTCD治疗T2DM靶蛋白PPI网络

2.4 KEGG通路富集分析

使用Metascape平台对45个JTCD治疗T2DM的潜在作用靶点进行KEGG通路分析。根据每个条目的P value从小至大进行排序，筛选前15条目，并采用OmicShare网站对结果进行可视化。

图4示，KEGG分析筛选出15条通路，主要是癌症中的蛋白聚糖、胰岛素抵抗、雌激素信号通路、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抵抗、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等。

图3示，气泡面积大小代表属于这个条目的基因数量，气泡越大表明基因数目越多；气泡颜色代表P value从红色至绿色、P value由小变大；RichFoctor为输入基因属于该条目的基因数量与该条目中所有基因数量的比值。

图3 JTCD治疗T2DM 的KEGG通路富集分析

2.5 JTCD治疗T2DM“成分-靶点-通路”网络构建

图4示，将JTCD治疗T2DM相关作用靶点和KEGG通路信息导入Cytoscape 软件中，构建“成分-靶点-通路”网络。在导出的网络图中，以不同颜色的圆圈节点表示成分、靶点以及通路。蓝色圆圈节点代表JTCD的化学成分，紫色圆圈节点代表靶点，红色圆圈节点代表通路。若某一靶点为某一成分的潜在靶点，则以边相连；若某一蛋白能够调节某条通路，也通过边连接。从图6可以看出，同一成分对应多个作用靶点和多个成分对应同一靶点的关系，体现了JTCD多成分、多靶点治疗T2DM的作用特点。

图4 JTCD治疗T2DM “活性成分-靶点-KEGG 通路”网络

3 讨论

据临床文献报道，JTCD在治疗T2DM上能取得不错的疗效。康继孔[7]等在西医治疗的基础上加用JTCD治疗T2DM 70例，结果发现中西医结合疗效好于单用西医疗效，总有效率高达92.9%。孟庆海[8]等用JTCD治疗T2DM 35例，治疗2个月后患者的空腹血糖 (FBG)、餐后2 h血糖 (2 h PBG)以及糖化血红蛋白(HbA1c)较治疗前有明显改善。另有药理学研究表明[9-11]，JTCD能够很好地防治T2DM及其引起的并发症。朱章志等[12]研究发现，JTCD能显著降低糖尿病大鼠的血糖、血脂以及PI3K mRNA、Akt mRNA水平，从而有效地延缓糖尿病大血管病变。徐阳等[13]研究表明，中药复方JTCD能够有效抑制糖尿病大鼠体内转化生长因子-β(TGF-β)表达，并升高胰岛素样生长因子-1(IGF-1)表达，从而有效地抑制糖尿病大血管向纤维化发展。

本文采用网络药理学方法，研究JTCD治疗T2DM的作用机制。“JTCD化学成分的筛选”结果表明，β-谷甾醇、表儿茶素等是JTCD关键药物活性成分。β-谷甾醇是一种天然的药物成分，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化、抗动脉硬化等作用[14-16]。Ponnulakshmi R[17]等表明，β-谷甾醇能通过2型糖尿病大鼠脂肪组织中的IR和GLUT4来改善血糖水平；表儿茶素是食品、植物和中药材中的重要活性成分之一，其具有很好的降糖降脂、抑制胰岛素抵抗等作用[18]。

“JTCD抗T2DM靶蛋白PPI网络分析”结果显示，AKT1、SRC、EGFR、CASP3、NOS3的Degree值排在45个靶蛋白前5位, 提示这5个靶蛋白很可能在JTCD抗T2DM中发挥着关键作用。RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)是PI3K /Akt信号传导通路的关键环节，在调控细胞生存、蛋白合成以及胰岛素依赖等方面具有重要作用[19]。余红等[20]实验结果显示，糖尿病大鼠肾组织中AKT1过度表达，而丹芪合剂可降低AKT1表达水平，阻碍肾脏纤维化，改善糖尿病肾病。另有研究发现，糖尿病肾病肾组织中表皮生长因子受体(EGFR)表达水平较高，抑制EGFR信号通路表达具有潜在的治疗糖尿病肾病的作用[21]。内皮型一氧化氮合酶(NOS3)是NO合成途径的关键酶，血管内皮细胞中的NO具有抗炎、抗血栓形成、抗动脉硬化的功能，是维持正常血管内皮功能所必需的[22]。国外研究发现，胰岛素可诱导NOS3活化、增加NO合成，抑制糖尿病血管并发症的发生发展[23]。目前关于SRC、CASP3对T2DM作用的文献报道较少，但本文利用网络药理学方法预测SRC、CASP3是JTCD治疗T2DM的关键靶蛋白之一，可为其实验研究提供新的思路。

KEGG通路分析结果显示，JTCD治疗T2DM涉及雌激素信号通路、VEGF信号通路、AGE-RAGE信号通路等信号通路。有研究表明[24]，随着女性年龄的增加，T2DM发病率增加，提示雌激素可能参与T2DM的发生。而雌激素可能通过降低血糖血脂、抗氧化应激、改善胰岛素抵抗等方面对T2DM产生治疗作用[25]。血管内皮生长因子(VEGF)是目前最强的促血管生成因子，生理状态下VEGF在肾脏、眼等器官低表达，而在T2DM状态下其呈过度表达状态。该状态会促进眼部异常血管增生，亦可增加肾脏滤过膜的通透性，加重蛋白尿，从而导致T2DM眼部、肾脏并发症的发生[26]。AGE-RAGE信号通路是T2DM的经典学说之一，AGE与RAGE结合，激活细胞内多条信号传导通路，产生多种病理性细胞反应，促进T2DM及其并发症的形成与发展[27]。

本研究结果表明，JTCD治疗T2DM的过程涉及多个活性成分、靶点及通路，与中医药治疗疾病多成分-多靶标-多通路的特点相吻合。同时，本研究可作为JTCD治疗T2DM作用机制的预测探讨，为下一步实验研究提供思路与参考。