含醋酸菌粉末的食品对ICR小鼠的酒精性肝损伤的影响

陈小雪，田思敏，程永强

(中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京，100083)

在全世界的社交场合都有饮酒的传统，有报告称少量饮酒可降低总死亡风险[1]，但过度饮酒会对身心造成不良影响和社会损失[2]。例如从心理方面来看，过度饮酒可能导致判断力下降并做出反社会行为。另外从生理方面来看，可能导致头痛、恶心，甚至肝损伤。初期症状可见因肝脏脂肪蓄积[3]、肝细胞损伤导致的谷草转氨酶(glutamic oxaloacetylase, AST)和谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)流出释放至血液中[4]。症状恶化会发展成肝炎、肝硬化、肝癌[5]，症状越严重则越难治疗，因此尽早采取治疗对策尤为重要。

过量饮酒导致的这些现象是由于乙醇及其代谢物乙醛引起的。摄入的乙醇主要在肝脏中通过乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)途径被代谢[6]，当摄入的乙醇量超出体内ADH和ALDH活性容许量时，乙醇和乙醛就会滞留在体内，对机体产生各种影响[7]。其中乙醛具有强毒性，被国际癌症研究机构确认为Ⅰ类致癌物，会通过氧化应激形成脂质、蛋白质加成物，对肝脏细胞造成损伤[8]。ADH和ALDH的活性因人而异，亚洲人与其他人种相比，低活性型即“酒量差”的人较多[9]。

醋是自古以来餐桌上常用的调味料，除了具有调味功能之外，还有抑制血压升高和促进钙吸收等保健功能[10-11]，部分醋(山西老陈醋、柿子醋等)具有高抗氧化功能，可减轻酒精性肝损伤[12-13]。正如醋的英文单词“vinegar”来源于“酸红酒”的含义，醋是醋酸菌利用酒精发酵制成的。醋酸发酵过程与酒精在人体中代谢的过程类似，是由醋酸菌利用其ADH和ALDH进行的[14]。

我们关注到醋的制造工艺与乙醇在人体肝脏中代谢的类似性，提出了以下假设，即按照醋的制造工艺，精制出具有ADH和ALDH活性的组分，将其与乙醇同时摄入，或许乙醇能够在体内被代谢成为醋酸，以减轻乙醇和乙醛的毒性。在此之前，已有相关研究阐明具有ADH和ALDH活性的醋酸菌粉末(acetic acid bacterial powder)与乙醇同时摄入可降低人体呼气和血液中的乙醇浓度[15]。此外，在对小鼠的经口喂食试验中，冻干醋粉末减轻了因亚急性酒精摄入导致的肝损伤和急性酒精摄入导致的肝脏脂肪蓄积[16]。在本研究中，给小鼠喂食项目组开发的含醋酸菌粉末的营养辅助食品(acetic acid bacterial powder-containing food, AF)，并研究其对酒精急性摄入导致肝损伤的减轻作用。

1 材料和方法

1.1 样品

供试样品为AF胶囊内容物(日本丘比株式会社提供)，保存条件：4 ℃冷藏保存。

1.2 实验动物

选用北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)2016—0006)提供的无特定病原体(specified pathogen free, SPF)级雄性美国癌症研究所(Institute of Cancer Research, ICR)小鼠，共50只，体质16～18 g，适应环境3～5 d后，进行实验。按体质进行随机分组，每组10只。所有动物实验均以实验动物饲养和储存以及疼痛缓解标准为基础，经CAIQtest动物研究委员会审核批准。

1.3 主要仪器与试剂

Synergy HIM多功能酶标仪,美国伯腾仪器有限公司; TBA-120FR全自动生化分析仪,东芝;PK-0200S匀浆器,美国PRO;CRYOSTAR NX50冰冻切片机,Thermo。

丙二醛(malondialdehyde, MDA)测定试剂盒(南京建成，批号：20190326); 还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)测定试剂盒(南京建成，批号：20190220); 总蛋白(total protein, TP)测定试剂盒(南京建成，批号：20190119);甘油三酸酯(triglyceride, TG)测定试剂盒(中生北控，批号：181001); AST测定试剂盒(中生北控，批号：180791);谷草转氨酶(glutamic oxaloacetylase, ALT)测定试剂盒(中生北控，批号：190851); 葡萄糖(glucose, GLU)测定试剂盒(中生北控，批号：180831);胆固醇(cholesterol, CHO)测定试剂盒(中生北控，批号：181641)。

1.4 剂量选择与受试物给予方式

设0.033、0.067、0.200 g/kg AF胶囊内容物，同时设模型对照组和空白对照组。称取0.33、0.67、2.00 g AF胶囊内容物，分别用植物油定容至10 mL，即为低、中、高剂量组，临用前配制，模型对照组和空白对照组给予植物油，各剂量组均按0.01 mL/(10 g BW)给予灌胃。

1.5 实验方法

参考文献[17]并改进了乙醇给予的方法。指标测定前一天，称量小鼠体质量，空白对照组直接给予植物油(0.01 mL/10 g)；模型对照组1次灌胃给予植物油(0.01 mL/10 g)和体积分数50%乙醇(0.48 mL/40 g)；剂量组1次灌胃给予不同剂量的受试样品(0.01 mL/10 g)和体积分数50%乙醇(0.48 mL/40 g)。禁食不禁水16 h，拔眼球采血1.0～1.2 mL，3 500 r/min离心10 min，收集血清，血生化仪测定AST、ALT和GLU。解剖取肝脏称重，计算肝脏质量与体积比，取肝右叶0.5 g，按质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆制成10%(质量分数)肝匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液待测，参照试剂盒说明书测定肝匀浆MDA、GSH含量，使用血生化仪测定肝匀浆TG及CHO含量。

从肝左叶中部做横切面取材，冰冻切片后，油红O染色[18]，从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用40倍物镜连续观察整个组织切片。主要观察脂滴在肝脏的分布、范围和面积。具体评分标准如表1所示。

表1 评分标准

2 结果与分析

2.1 小鼠体重水平

由表2可知，经统计学分析，小鼠体质量在各剂量组与模型对照组间比较，均无显著性差异(P>0.05)。

表2 小鼠体质量情况

2.2 AF对小鼠肝脏MDA、GSH、TG及CHO水平的影响

由表3、表4可知，经统计学分析，模型对照组与空白对照组比较，肝脏MDA、TG、CHO水平升高，GSH水平降低，可判定造模成功。给予受试物后，高剂量组的GSH水平高于模型对照组，差异具有显著性(P<0.05)；中、高剂量组的TG水平低于模型对照组，差异均具有显著性(P<0.05)；中剂量组CHO水平低于模型对照组，差异均具有显著性(P<0.05)；其MDA水平在各剂量组与模型对照组间比较，差异均无显著性(P>0.05)。

表4 AF对小鼠肝脏TG及CHO水平的影响

表3 AF对小鼠肝脏MDA及GSH水平的影响

2.3 AF对小鼠血清AST、ALT、GLU水平的影响

由表5可知，经统计学分析，模型对照组与空白对照组比较，血清AST、ALT、GLU水平升高，可判定造模成功。给予受试物后，高剂量组的ALT水平低于模型对照组，差异具有显著性(P<0.05)；低、高剂量组的GLU水平低于模型对照组，差异均具有显著性(P<0.01)；各剂量组AST水平与模型对照组比较，差异均无显著性(P>0.05)。

表5 AF对小鼠血清AST、ALT及GLU水平的影响

2.4 病理组织学检查结果

由图1及表6可知，经统计学分析，模型组病理评分高于空白对照组，可判定造模成功。空白对照组小鼠肝小叶结构相对较完整，脂肪变性程度较轻；而模型组小鼠肝小叶结构破坏，脂肪变性明显；高剂量组小鼠肝脏脂肪变性程度较模型组明显减轻，高剂量组病理评分低于模型组，差异具有显著性(P<0.05)。

图1 肝脏脂质积累组织学的分析(40倍物镜)

表6 AF对小鼠肝脏病理组织学检查结果的影响

3 讨论与结论

为了将功能性成分制成便于摄入的形态，在含醋酸菌粉末作为主要原料的基础上，添加了赋形剂、分散剂等各类成分。因此，与摄入功能性成分单体相比，作为复合形态的AF功能表现可能有所不同。本课题组曾报告醋酸菌粉末对因摄入酒精导致的肝脏脂肪蓄积具有减轻作用[16]，而在本研究中，使用醋酸菌粉末作为原料制造的AF也具有同样效果。此外，AF对因摄入酒精导致的ALT水平升高也有抑制作用。由此可知，AF可用作减轻肝损伤的营养辅助食品。

AST和ALT会由于肝脏细胞受到损伤而流出至血液中，从而成为临床上使用的肝功能指标。朱诗雅等[19]利用这2个指标评价了不同乳杆菌对慢性酒精性肝损伤的缓解作用。但AST与ALT器官特异性不同，ALT几乎只单独存在于肝脏，而AST除了存在于肝脏之外，还广泛存在于心肌、骨骼肌、红细胞等组织[20]。在本研究中，AF对因摄入乙醇导致的ALT升高有减轻作用，而对AST水平升高无影响。由此可知，AF通过肝脏来发挥特异作用。

在本研究中，摄入酒精除了导致肝脏脂肪蓄积之外，还可见血糖值升高。脂质代谢和糖代谢具有相互影响的作用[21]。AF通过减轻因摄入酒精导致的肝脏脂肪蓄积，因此还可能会同时减轻血糖值的升高。但是，AF对血糖值的影响与浓度无相关性，因此推测除了AF的减轻脂肪蓄积作用之外，还有其他因素的影响。

肝脏中的胆固醇通过合成与分解、排泄的平衡来维持稳定[22]。有研究表明，在大鼠试验中，喂食酒精4周会导致胆固醇代谢异常[23]。在本研究中，可见急性摄入乙醇导致肝脏胆固醇量增加，由此可知，单次摄入乙醇也会对肝脏的胆固醇代谢造成影响。本研究结果显示AF对肝脏胆固醇蓄积的减轻作用与浓度无相关性，其详细机制还有待于进一步研究。

综上所述， AF对急性酒精性肝损伤小鼠具有一定肝脏保护作用，可减轻因乙醇导致的肝损伤。