响应面法优化索式提取艾草精油的工艺研究

李健鹏，李险峰，陈鸿雁，肖定书

（惠州学院 化学与材料工程学院/大亚湾化工研究院，广东 惠州 516007）

艾草，又名医草，海艾，炙草等别称，广泛分布于中国大部分地区、蒙古、俄罗斯、朝鲜等国家和地区.艾草可以制成美味的糕点，例如，将艾草与糯米粉、糖等调味料混合进行蒸煮可制成可口的艾粄，目前，有企业以艾草为绿色安全添加剂，制作成一系列的食品和配料.除了食用外，艾草在中医上被认为，具有温经、袪湿、除寒等作用，例如市面上有售的艾草脚贴、艾草医用贴膏和精华素等.另外，实际的临床经验证明，艾草具有止血、消炎、平喘、止咳、安胎、抗过敏等作用.近年来，随着人们对艾草的深入研究，发现艾草对人体生理功能有重要的调节作用.例如Shi等人［1］从艾草提取的水溶性多糖并研究其在体外免疫调节作用，研究发现，艾草的多糖可以促进免疫球蛋白，细胞因子的产生以及体外NO浓度的产生.Huang等人［2］采用艾草精油探索其抗炎和活化血瘀活性，结果表明，皮肤给药的所有剂量的精油均可显着降低二甲基苯诱发的耳部水肿和角叉菜胶诱发的爪水肿的肿胀，并降低冰醋酸诱发的腹腔毛细血管的通透性，具有良好的消肿性.Shi等人［3］研究表明，补充500 mg/kg的精油可以显着提高小肠的过氧化氢酶活性，并且空肠的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性得到改善，表明艾草的提取物可以提高小肠的抗氧化能力.

艾草的化学成份很复杂，提取物有挥发性油、黄酮类、桉叶烷类和三菇类等化合物［4］.目前，常用的提取艾草精华液的方法主要是常规蒸馏法［5］，此方法提取率低，时间长，能耗高；另外，近年来，发展起来的微波萃取技术有利缩短提取时间，并且微波功率可控，达到选择性高的目的［6］.但是微波过程在短时间内带来的高功率高热量容易使艾草的精华液发生氧化变性，因此发展一种简便，高效提取艾草精华液仍然是一项有待解决的技术难题.索式提取是基于溶液回流和虹吸原理，它将溶剂蒸气源源不断地通入提取器内，对固体物质进行纯溶剂的萃取，当溶剂的液面超过虹吸管的最高处时，溶液回流至溶剂底部，因此它可以萃取出固体物质的有效成份，具有萃取效率高，易操作，易控制等特点，目前，国内对艾草精华液的提取工艺有一定的研究，但以索式提取器提取艾草精华液的研究鲜有报道，而且目前所报道的工艺都是基于实验进行逐步探索，缺乏一种高效的统计理论指导作为优化提取工艺参数的方法.响应曲面法是基于随机过程的统计学试验方法，它能够建立连续变量的曲面模型，优化工艺参数，它可以通过对实际若个自变量对实际因变量的评价，从理论上给出最优方案，此方法节省了大量的时间和人工劳动力，达到高效地理论指导实践的目的.该论文根据响应面优化法设计原则，优化索式提取器提取艾草精华液的工艺条件，为提取艾草精华液的工艺提供一定的参考依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜艾草茎叶：购自惠州马庄市场，该批艾草种植于马庄福长岭农田区，收割于八月份，约60cm高，经过60 C鼓风干燥箱烘干后用球磨机粉碎并筛分80目以下的粉末作为抽提物；100%乙醇，国药集团化学试剂有限公司.

1.2 主要仪器设备

JJ600型电子天平：美国双杰高电子天平有限公司；752N-Plus紫外可见分光度计：上海仪电物理光学仪器有限公司；101A-3ET型电热鼓风干燥箱：上海沪粤明科学仪器有限公司；UV2401PC紫外可见分光光度计：杭州库伦科技有限公司；高速中药粉碎机：郑州长城科技贸工有限公司.

1.3 艾草精华液的提取

准确称取艾草粉10 g放入150 mL索式提取器的滤纸筒中，在圆底烧瓶加入90 mL一定浓度的乙醇溶液，水浴加热回流至虹吸管的冷凝液刚刚虹吸下去时即可表示反应完成，停止反应，稍冷后，改成蒸馏装置，把提取液中的乙醇蒸出，趁热把瓶中的剩余液稀释定容至500 mL以作进一步的测试.

1.4 艾草精华油最大波长的确定

取稀释后精华液1 mL，扫描其紫外-可见光谱，结果如图1所示，其最大吸收波长为670 nm，以此波长作为最大吸收波长作吸光度值的测试.

图1 艾草精华液的紫外-可见吸收光谱图

1.5 单因素实验

以10 g粉碎的艾草为提取物，在固定浓度为90%的乙醇水溶液，液料比为40∶1，提取温度为75 C的条件下，变动其中一个因素，按照2.3的步骤得到精华油，并测试其吸光度，以验证艾草精华液的相对含量高低.

乙醇水溶液的浓度：100%、90%、80%、70%、60%、50%（体积比）等6个水平浓度.

液料比分别为：10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL∶g）等6个比例加入无水乙醇.

提取温度分别为：60°C、65°C、70°C、75°C、80°C、85°C等6个水浴温度下提取.

1.6 响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，以提取的艾草精华液在分光光度计670nm处的吸光度为测试值，以乙醇水溶液的浓度、液料比和提取温度为自变量，采用三因素三水平的响应面分析方法，在Design-Expert.8.06分析软件上采用Box-Behnken中心组合实验设计，对提取艾草精华油工艺进行优化，试验因素和水平见表1.

表1 响应面试验因素水平表

2 艾草精华油提取工艺的优化

2.1 乙醇浓度对吸光度的影响

从图2可以看出，随着提取工艺中乙醇浓度的升高，吸光度增加，这是由于高浓度的乙醇有利于浸出艾草中的精华油，在实验过程中也发现，随着乙醇浓度的提高，提取液由淡黄色变成亮绿色.因此选用浓度为100%乙醇作为最佳的提取剂.

图2 不同的乙醇浓度对提取的艾草精华油的吸光度的影响

2.2 液料比对吸光度的影响

从图2可以看出，液料比增大时，吸光度增加.液料比在10∶1-20∶1和50∶1-60∶1这两个阶段变化不大，这是由于液料比在这两个阶段都处于最高值和最低值，在低料液比时，溶剂萃取效率较低，因此精华油的浓度较低，吸光度较小，在50∶1-60∶1处的液料比时，由于溶剂增加，能够促进精油的溶出，因此吸光度最高，但较多的溶剂容易造成溶剂的浪费.综合经济上的考虑，选取50∶1比较合适.

图3 不同的液料比对提取的艾草精华油的吸光度影响

2.3 提取温度对吸光度的影响

从图4可以看出，随提取温度的增加，吸光度呈现先增加后减少的趋势，当温度在80 C时，其提取效率最高.这可能是当温度升高时，艾草精华油的分子运动变得更加剧烈，易于从艾草体相中溶出，使精华油的浸出率增加.但是过高的温度如85 C时会使精华油分子分解从而遭到破坏，使析出精油的颜色深度降低，导致吸光度降低.因此，选取80 C作为提取温度较合适.

图4 不同的提取温度对提取的艾草精油的吸光度影响

3 响应面试验设计与结果

基于上述实验结果，为了使吸光度的值相对误差最小，对所得到的溶液再稀释至原来2倍体积，使吸光度的值落在0.15-0.80范围内.以乙醇的浓度、液料比和提取温度为自变量，以吸光度值为响应值，根据Box-Behnken的试验原则设计三因素三水平的试验，试验设计及结果见表2.

表2 响应面试验设计与结果

根据软件Design-Expert.8.05b分析的结果，进行二次多元回归拟合，得到吸光度（Y）对乙醇的浓度（A）、液料比（B）和提取温度（C）的二次多项回归方程为：

表3 回归方程各项方差分析表

图5 A乙醇浓度和B液料比（a）、A乙醇浓度和C提取温度（c）、B液料比和C提取温度（c）与吸光度值组成的响应曲面及三维立体等高线图

由表3回归方程各项方差分析表可知，模型的F值为31.37（P＜0.001），表明该模型达到极为显著水平，当有噪声影响时，仅有＜0.01%的机率出现误差.表中，当P＜0.001时，表示该项表现为极显著，当P的值＜0.0500时，表示该项表现为显著.从表可以看出，液料比（B）和提取温度（C）对艾草提取精华油吸光度显著，而乙醇浓度对艾草提取精华油的吸光度不显著，乙醇浓度和液料比之间两两因素的交互作用影响显著，而乙醇浓度和提取温度、液料比和提取温度的两两因素交互作用影响不显著.决定系数（R2=0.9758）与调整系数（Radj=0.9447）相差不大，说明该模型拟合度良好，适用于确定该实验最佳工艺.

图5是表3结果中AB、AC和BC两两因素交互作用，即乙醇浓度和液料比、乙醇浓度和提取温度、液料比和提取温度与吸光度值组成的响应曲面及三维立体等高线图，它表征的是各因子之间的两两交互作用.

在这些图中，选取其中两个自变量，其它因素不变对其进行响应面分析.当等高线的形状越圆时，两个自变量的因素作用较弱，当等高线呈现椭圆形时，这两个自变量的因素作用就越强.从图5a可以看出，当提取温度一定时，随着乙醇浓度和液料比的增加，吸光度呈现先急速增加后趋于平缓；表明乙醇浓度和液料比对吸光度影响显著；对于5b和5c的3D图可以看出，当液料比（乙醇浓度）固定时，随着两两交互因素的数值增加出现一个最高值，然后吸光度减小，但5b比5c曲线更平滑，说明AC比BC的两两交互因素影响更弱，这与前面的表3的P值结果描述相一致.

由软件得到了提取艾草精华油最佳的条件为乙醇浓度90.27%、液料比41.78、提取温度76.32 C，在此最优条件下软件算得的吸光度为0.646.考虑到实际的可操作性，将条件调整为：乙醇浓度90%、液料比40、提取温度76 C，经过3次平行重复的实验，得出艾草精华油的平均吸光度为0.638，与方程预测值的相对误差为1.24%.由此可知，实验的结果与所设计的模型相符，说明通过响应面优化法得到的索式提取器提取艾草精油的工艺条件是合理的.

4 结论

该实验通过响应法优化艾草精华油的提取，结合理论的预测与实验的操作，得到乙醇浓度90.27%、液料比41.78、提取温度76.32 C，在此最优条件下软件算得的吸光度为0.646.考虑到实际的可操作性，将条件调整为：乙醇浓度90%、液料比40、提取温度76 C，经过3次平行重复的实验，得出艾草精华油的平均吸光度为0.638.其模拟的回归方程为

通过方差与面响应图分析得出，各因素对艾草精华油的提取影响重要性依次为：液料比＞提取温度＞乙醇浓度，而两两交互因素影响大小依次为：乙醇浓度和液料比＞液料比和提取温度＞乙醇浓度和提取温度.