三种滇西地区药用黄芩属植物与正品黄芩抗菌活性研究

刁红梅 吴秀蓉 肖朝江 姜 北

大理大学药物研究所，云南 大理 671000

黄芩属(ScutellariaLinn.)植物种类繁多，部分有药用记载，多用于清热解毒、抗菌消炎[1]，其中黄芩(Scutellariabaicalensis)作为正品中药材主要分布在东北、华北、西北地区东部[1]。在上述地区之外，一些当地分布的黄芩属植物也常作为黄芩代用品药用，特别是西南地区黄芩属植物种类多、资源丰富，黄芩代用品现象更加常见，如滇黄芩(S.amoena)在《滇南本草》中便明确可以代黄芩药用。在云南滇西地区，当地纳西族、彝族、白族等少数民族也有用滇黄芩(S.amoena)(白语亦称作“黄芩”)、丽江黄芩(S.likiangensis)(纳西语“shidailaiki”)、半枝莲(S.barbata)(白语“奢每粗”)等代替正品黄芩药用的传统[1]。根据《中国植物志》，黄芩、滇黄芩、丽江黄芩均为黄芩属黄芩亚属顶序黄芩组狭叶黄芩亚组植物[1]，在植物分类学上具有较高的近缘性与相似度，因此滇黄芩、丽江黄芩作为黄芩的代用品具有一定的植物分类学基础，但半枝莲在植物分类学上与黄芩相隔较远[1]，因此，是否可以代用存在一定的疑问。另一方面，黄芩属植物资源虽然十分丰富，但现代研究常限于几种常见的药用植物，许多代用品在化学成分、药理药效方面研究很少，因此，无法系统评估这些植物潜在的应用价值与替代黄芩药用的合理性。为此，本课题对采自滇西地区三种常见黄芩属药用植物滇黄芩、丽江黄芩、半枝莲以及市售正品中药材黄芩进行了抗菌活性对比性研究，为认识这几种黄芩属植物与黄芩替代使用可行性、科学合理地开发滇西黄芩属植物资源提供初步的基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 供试样品 滇黄芩、半枝莲植物样品2019年7月采自云南省大理州洱源县；丽江黄芩植物样品2019年8月采自丽江玉龙县。经大理大学生药学教研室张德全博士鉴定为滇黄芩(Scutellaria amoena C. H. Wright)、半枝莲(Scutellaria barbata D. Don)和丽江黄芩(Scutellaria likiangensis Diels)。正品黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)2019年8月购自大理市当地药店。上述四种样品的地下部分各约10 g，粉碎后分别以85%乙醇200 mL冷浸提取3次，每次24 h，再以超声提取2次，每次30 min，合并提取液，减压浓缩，冻干，分别得样品粗提物冻干粉。

1.2 供试菌种 实验所用金黄色葡萄球菌(批号：ATCC 25923)、痢疾杆菌(批号：ATCC 25927)、大肠杆菌(批号：ATCC 25922)均由大理大学基础医学院病原生物学综合实验室提供。

1.3 试剂与仪器 甲醇(赛默飞世尔科技中国有限公司，色谱纯)，甲酸(天津市化学试剂三厂，分析纯)，实验用水为哇哈哈纯净水。EL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，SB25-12 DTDN超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，RE-5205型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)，SW-CJ-2FD超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，多功能酶标仪(赛默飞世尔科技中国有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 培养基配制 LB液体培养基(牛肉膏蛋白胨液体培养基)：取100 mL去离子水，加入洗净的搅拌子，置磁力搅拌机上，依次加入胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 2 g，溶质全部溶解后加去离子水至200 mL，转入锥形瓶，封口。经121℃高压蒸汽灭菌锅灭菌30 min，烘干后冷却备用。LB固体培养基(牛肉膏蛋白胨固体培养基)：取100 mL去离子水，加入洗净的搅拌子，置磁力搅拌机上，依次加入胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 2 g、琼脂粉4 g，搅拌均匀后加去离子水至200 mL，转入锥形瓶，封口。经121℃高压蒸汽灭菌锅灭菌30 min，烘干后冷却至50～60℃，倒制平板。

1.4.2 菌液制备 在超净工作台上，将金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌以三区划线法接种在相应的LB固体平板上，每个菌种接种2个平板，置28℃恒温培养箱中培养36 h后，挑取单个菌落置LB液体培养基中，置27℃摇床(160 rpm)培养6～8 h，菌液浑浊后以LB液体培养基稀释10000倍，即成病原菌稀释液(约为1.0×104 CFU/mL)。

1.4.3 供试品溶液配制 以上4种样品粗提物各称取24 mg，溶于6 mL无菌水中，以0.22 μm微孔滤膜除菌，将供试品配置成初始浓度为4 mg/mL储备液，取储备液，以无菌水系列稀释。

1.4.4 实验操作 在灭菌96孔板上，每个样品浓度平行加4个复孔，分别取50 μL供试品溶液及50 μL菌液混匀，使各孔最终体积为100 μL，同时做空白对照(50 μL LB液体培养基+50 μL菌悬液)、空白培养基对照(100 μL LB液体培养基)，将96孔板置28℃培养箱中培养15～18 h后，用酶标仪检测各孔OD600 nm值。

供试品对大肠杆菌及痢疾杆菌的终浓度为：2.00、1.50、1.00、0.75、0.50 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的终浓度为：0.50、0.40、0.30、0.20、0.10 mg/mL。

根据OD600 nm值，计算各浓度下样品对细菌的生长抑制率，计算公式如下：

细菌的生长抑制率% =(空白对照OD600值 - 供试品OD600值)/空白对照OD600 值×100%

以样品浓度为横坐标，各浓度下抑菌率的均值为纵坐标绘制回归曲线，根据回归曲线计算当抑制率为50%时的样品浓度，即IC50值。

1.4.5 供试样品HPLC分析 上述4种样品粗提物各取30 mg，以2 mL色谱级甲醇超声溶解，0.45 μm滤膜过滤，配制成浓度为15 mg/mL供试样品溶液。HPLC分析条件为：分离柱为Agilent SN USCM052204 SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)；梯度洗脱：0～10 min，5%～25%(B)；10～90 min，25%～65%(B)；90～100 min，65%～100%(B)；100～105 min，100%(B)；柱温30℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长为254 nm。

2 实验结果

2.1 四种供试黄芩属植物样品的抗菌活性 四种黄芩属植物供试样品对各菌种的生长抑制活性实验结果如表1、表2所示，四种黄芩属植物对各菌种的生长抑制率曲线如图1所示。根据抗菌活性实验结果，四种黄芩属植物供试样品对大肠杆菌、痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均有抑制作用。以IC50值为依据，各供试样品对痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制活性明显，对大肠杆菌的生长抑制作用稍弱；同时，滇黄芩、丽江黄芩对痢疾杆菌的生长抑制作用显著优于黄芩、半枝莲。总体来看，三种滇西地区黄芩属植物样品抑菌活性优于市售正品黄芩样品。

表1 四种黄芩属植物对大肠杆菌、痢疾杆菌的抑制率

表2 四种黄芩属植物对金黄色葡萄球菌的抑制率

(A)大肠杆菌；(B)痢疾杆菌；(C)金黄色葡萄球菌图1 四种黄芩属植物供试样品对各菌种的生长抑制曲线

2.2 四种供试黄芩属植物样品HPLC分析结果 四种黄芩属植物样品的HPLC分析结果如图2所示。根据HPLC分析结果，滇黄芩与丽江黄芩的主要化学成分较为相似，仅在9号峰上两者有一定的差异，显示丽江黄芩的化学成分更具多样性。同时滇黄芩与丽江黄芩的主要化学成分均较正品黄芩丰富，特别是含有正品黄芩中未见的3号峰，同时，5、6号峰的含量也远远大于正品黄芩，仅在7号峰上与正品黄芩有所不同。根据上述谱峰的UV谱图(图3)，3、5、6、7号峰具有十分相似的UV谱图，显示这些谱峰应来自同一类型的黄芩属植物所含有的黄酮类成分[2-7]，应该是黄芩属植物抗菌消炎等药用功效的主要物质基础，由此推断滇黄芩与丽江黄可能具有较正品黄芩更好的功效与品质。

HPLC分析结果显示(图2)，半枝莲与其它三种黄芩属植物样品的主要成分组成有较大差异，相关谱峰的UV谱图(图3)也显示其主成分9号峰与黄芩属植物含有的黄酮类成分在结构类型上有一定的差异，因此，半枝莲在抗菌活性以及药用记载上与滇黄芩、丽江黄芩等有所不同也属合理。

图2 四种黄芩属植物供试样品的HPLC谱图(254 nm)

图3 HPLC谱图中几个主要谱峰的UV谱图

3 讨论

黄芩属植物我国南北均产，除正品黄芩(S.baicalensis)药用外，据《新编中药志》记载，另有甘肃黄芩(S.rehderiana)、粘毛黄芩(S.viscidula)、滇黄芩(S.amoena)、丽江黄芩(S.likiangensis)、连翘叶黄芩(川黄芩)(S.hypericifolia)等5种黄芩属植物在各地亦做黄芩药用。根据《中国植物志》，这5种黄芩属植物外加正品黄芩均为黄芩属黄芩亚属顶序黄芩组狭叶黄芩亚组植物，应该并非巧合。前人曾采用聚类分析[8]、主成分分析[9]、数量分类[10]等方法分析了正品黄芩与非正品黄芩间的关系，均证明这几种黄芩属植物与正品黄芩的亲缘关系十分接[11-12]，因此这几种黄芩代用品从植物分类学角度来看应该具有一定的合理性，但在化学成分与药理药效学研究方面缺乏系统的研究报道。

根据文献报道，正品黄芩对大肠杆菌、痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制活性[2-7]，为此，本研究特意选取这三种致病菌用以探讨三种滇西地区黄芩属植物与正品黄芩的抗菌活性差异。实验结果显示，滇黄芩与丽江黄芩化学成分最为相近，两者对大肠杆菌以及痢疾杆菌的抑制活性也十分相似，均与滇黄芩与丽江黄芩在植物分类学上亲缘关系最为接近完全吻合。滇黄芩、丽江黄芩较正品黄芩的化学成分更为丰富，含有正品黄芩中未见的3号峰，同时，5、6号峰的含量也远远大于正品黄芩，故滇黄芩、丽江黄芩的抑菌活性也往往优于正品黄芩。而半枝莲与其它几种供试黄芩属植物样品的亲缘关系较远且化学成分相差较大，对几种菌种的抑制活性也确实与滇黄芩、丽江黄芩不同，但半枝莲却仍表现出一定的抑菌活性，其作用机制还有待进一步研究。本研究为基于传统植物分类学寻找、开发药用植物资源、挖掘民族医药潜力提供了一个研究例证。

综合而言，滇黄芩、丽江黄芩在抑菌活性方面优于正品黄芩，且化学成分较正品黄芩类型相似、内容更加丰富，初步证实了这几种黄芩属植物具有替代正品黄芩药用的合理性。滇西地区黄芩属植物资源丰富，本研究为深入认识滇西地区黄芩属植物品质、科学合理地开发滇西黄芩属植物资源提供了初步的实验依据。