显微镜辅助下结肠区段切除术在裸鼠结肠癌模型中的应用研究

杜继明 王贵鑫 赵雪峰 宫爱民

（大连大学附属新华医院肛肠外科，辽宁 大连 116021）

在动物实验领域，传统的原发性结肠癌及其转移性结肠癌模型的制作远远满足不了飞速发展的肿瘤手术缩小化理念需求，因此建立精准显微镜辅助下手术模型的制作迫在眉睫。近年来临床研究结果中，发现早期结直肠癌选择了以肿瘤为中心的局部切除手术和（或）附加前哨淋巴结清扫，与结肠癌根治性手术相比，其5年生存率无显著差异[1-2]。本研究首选建立稳定的结肠癌模型后，此基础上再建立结肠癌切除手术模型，并与开关手术模型相比较术中、术后情况及生存率情况。由于理论上可行的结肠癌根治手术模型的制作障碍，加上人力、物力及技术上的制约，只好选用了结肠区段切除手术模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料：7周龄雄性，体质量18～20 g，BALb/c品系20只实验裸鼠购于大连医科大学实验动物中心。人结肠癌细胞株HT29由大连大学附属新华医院医学研究中心构建并提供。本研究由经大连大学附属新华医院医学研究伦理委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和细胞混悬液制备：将人结肠癌细胞株HT29在37 ℃、5%CO2，含10%小牛血清的培养基内传代培养，每2～3 d洗换1次培养液。培养细胞融合达80%～90%，采用胰酶消化后，1200 rpm/min离心3 min，弃上清液，将无小牛血清的培养基加细胞洗涤3次，显微镜下细胞计数，用无小牛血清培养基调整细胞浓度至4×107/mL，共备1 mL。将已制备的细胞混悬液在冰浴中保存，备30 min内完成接种。

1.2.2 模型设计：制模前1周为实验裸鼠安定期，需对实验裸鼠禁止进行一切刺激性操作。参与模型的实验裸鼠共20只，首先建立稳定的裸鼠原发性结肠癌模型4周，其后将结肠癌模型裸鼠随机分成10只显微镜辅助下结肠区段切除术组（结肠癌切除手术模型组-研究组）和10只对照组（开关手术模型组）。建立结肠癌模型后实验裸鼠总观察周期为8周。

1.2.3 建立显微镜辅助下裸鼠结肠癌模型：选用地氟醚进行裸鼠全身麻醉。制模全程采用SMZ-B2/T2体视显微镜完成操作。首先，取下腹正中10 mm小切口进入腹腔，利用无损伤镊子寻找盲肠，并选定距盲肠根部30 mm“升结肠”作为制模部位。其次，采用31号注射器倾斜30°角进针约0.5 mm，将人结肠癌细胞株HT29混悬液50μL（细胞数为2×106）经“升结肠”黏膜层和肌肉层之间缓慢注入。待确认注射部位肠壁颜色变白、肿胀及无渗漏，采用止血纱布外加湿纱布覆盖注射部位1 min。最后，掀开湿纱布见脾脏无渗漏后逐层关腹。

1.2.4 建立显微镜辅助下裸鼠结肠区段切除术模型（结肠癌切除手术模型）：麻醉及开腹显露同上述。首先，采用钛夹或丝线结扎标记待切除的两侧肠管，切除范围为距肿瘤两侧缘1 cm。其次，选用裸鼠专用肠钳或血管钳钳夹两侧待吻合的肠管，切除肿瘤为中心的肠管后，采用10-0血管缝合线连续缝合。最后，见缝合处血运良好，并缝合牢固后止血纱布环周附于吻合口周围，且进行逐层关腹。

1.2.5 建立显微镜下裸鼠结肠癌开关手术模型：麻醉及开腹显露同上述。不进行对结直肠癌模型的任何创伤性操作。

1.2.6 解剖裸鼠和观察指标：每天常观察、记录实验裸鼠的一般状态，实验裸鼠观察期满予以处死。处死后立即解剖观察，并具体记录腹腔内血性腹水、肠梗阻、淋巴结肿大/转移及腹膜种植情况。完整移除病变标本后，利用4%多聚甲醛充分固定。所有病变标本以最大直径为中心切开并制作组织蜡块，并以4 μm厚度切片后进行H&E染色，显微镜下明确病变标本的性质。

1.3 统计学方法：采用SPSS 20.0统计软件包进行数据处理。研究组和对照组的计量比较采用χ2-test进行统计分析，研究组和对照组的生存分析采用Kaplan-Meler进行统计分析，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 两组制模情况比较：结肠癌模型成瘤率100%（20/20）。结肠癌切除手术模型组和开腹手术模型组在术中无1例死亡。结肠癌模型成瘤率100%（20/20）。结肠癌切除手术模型组术中无1例死亡。结肠癌切除手术模型组血性腹水、肠梗阻、淋巴结转移及腹膜种植转移明显少于开关手术模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组制模情况比较[n（%）]

2.2 两组生存情况比较：研究组组频临死亡处死1例，而观察期满8周处死9例；而对照组频临死亡处死7例，而观察期满8周处死3例。两组生存曲线分析，结肠癌切除手术模型组生存率明显优于开关手术模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 两组生存曲线

3 讨 论

对于建立稳定的裸鼠结肠癌模型是研究人结肠癌精准治疗的首要缓解。裸鼠结肠癌模型制作包括自发性肿瘤模型、诱发性肿瘤模型、移植性结肠癌模型及转基因动物肿瘤模型，无论选择任何方法都有它的长处和适应范围[3]。由于区域淋巴结转移是结直肠癌患者局部转移的第一步，因此裸鼠结肠癌淋巴结转移模型对抗肿瘤药物的筛查和肿瘤转移机制研究具有重要意义[4]。近期对裸鼠结肠癌淋巴管生成模型的制作研究也逐渐升温[5]。为了更进一步深入研究结直肠癌患者的转移机制和抗转移治疗方法，需求与人更接近或非细胞系的远处转移模型的制作[6]。为此，今后的动物模型制作方向应符合模拟人类疾病进展。裸鼠结肠癌模型的评价手段多种多样，譬如剖腹探查、MRI技术、IVIS技术及小动物专用PET/CT技术[7-9]。除剖腹探查外，其他的动物模型评价手段还仍未得到普及。

结直肠癌患者的治疗原则是以手术治疗为主的综合治疗，但人结肠癌实验动物模型建立的研究只停步在单纯建立裸鼠结肠癌模型的初步阶段[10]。由于实验用鼠科动物的肠管壁薄、粪便块似肠管粗大、肉眼或放大镜难以完成精准的吻合技术而肠切除相关的报道寥寥无几，更谈不上切除肿瘤周围水肿的肠切除术。显微镜辅助下肿瘤区段切除术的优势和技巧在于：①选择全身麻醉；②选用术野直观的体视显微镜；③显微镜的放大倍数高达4～40倍；④选用裸鼠专用肠钳或血管钳钳夹肠管；⑤选用10-0血管缝合线连续缝合法进行肠-肠吻合。不仅针对早期结肠癌行肿瘤为中心的局部切除加前哨淋巴结清扫，且针对早期直肠癌行TEM手术等技术理念的更新是本研究设计的初衷[1-2,11]。为提高显微镜下肠管吻合技术，建议显微镜或放大镜下连续缝合完成剪断胶皮手套的手指吻合后，灌满自来水观察有无渗漏。显微镜操作技术的可行性和肿瘤学行为的安全性方面，本研究结果证实：结肠癌模型成瘤率100%，同时结肠癌切除手术模型组和术中无1例死亡；结肠癌切除手术模型组血性腹水、肠梗阻、淋巴结转移及腹膜种植转移明显少于开关手术模型组，而且结肠癌切除手术模型组生存率明显优于开关手术模型组。

综上所述，结肠癌切除手术模型为操作技术要求较高的动物实验模型。结肠癌切除手术模型在技术层面上安全、可行，但在相对局部晚期结肠癌模型中的远期肿瘤学行为有待于进一步探索。