生长抑素受体mRNA在颅咽管瘤中的表达及其意义

杨瑞卿，易 维，陈科润，钱瑞仪，司马秀田

(1.四川大学华西临床医学院，四川 成都610041；2.四川大学华西医院 神经外科，四川 成都610041)

颅咽管瘤是颅内的常见肿瘤之一，发病率在我国呈现逐年升高的趋势，对颅咽管瘤的防治研究是当前的热点问题之一。正常组织的癌变过程会伴随着一系列的信号转导通路的改变，使得癌变组织逃避凋亡以及继续生长。生长抑素受体(somatostatin receptor，SSTR)是一种G蛋白偶联受体，在人体各种组织中普遍表达，其中肿瘤细胞中主要表达SSTR2[1]。在不同类型颅咽管瘤组织中检测SSTR2的表达差异，有助于探讨SSTR2在颅咽管细胞癌变发生以及不同类型的转变关系，为临床防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料

本组研究对象为颅咽管瘤标本和脑挫裂伤组织标本(对照组)，均来自于2010年6月至2011年2月华西医院神经外科经接受手术的患者。根据如下纳入及排除标准筛选样本：纳入标准：①无家族性疾病病史；②既往无手术史；③手术前无放疗、化疗史；排除标准：①合并严重多器官疾病；②合并身体其他部位的肿瘤；③术后病理切片初筛发现肿瘤组织稀少，大片坏死及血凝块等杂质过多者。最终收集病例36例，其中男性20例，女性16例。年龄6-62岁，平均29.4岁。釉质上皮型肿瘤(adamantinoma epithelium，AE)21例、鳞形乳头瘤型(squamous papilloma，SP)15例。对照组标本22例，男性15例，女性7例，年龄为22-47岁，平均32.6岁。所有研究对象均签署知情同意。手术切除样本置于无菌冻存管中液氮速冻，后移入-80℃冰箱保存备用。

1.2 定量PCR

1.2.1主要试剂及来源 Trizol购于美国罗氏公司，PCR反应缓冲液购自北京博大泰克公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 试剂盒购自Fermentas公司，2×SYBR购自Qiagen公司，引物由上海英俊公司合成，定量PCR仪购自德国Eppendorf公司。

1.2.2Trizol 试剂提取总RNA 取组织块50 mg用液氮在研钵中研磨成粉末,移入玻璃匀浆器加入1 ml Trizol 抽打匀浆,RNA提取方法按照试剂盒说明书进行。采用紫外分光光度计测定提取的RNA在260 nm/280 nm处的吸光度值，纯度在1.9-2.1者为合格样品，进入后续逆转录反应。

1.2.3逆转录合成cDNA 取1 000 ng RNA,逆转录合成cDNA第一条链：按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明合成。cDNA置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.4SSTR2 mRNA的相对表达量检测 以cDNA作为模板，β-actin作为内参照， DEPC水作为阴性对照，对SSTR2 mRNA进行相对定量。SSTR2引物：SSTR2上游：5′-TGCTGGGTCTGCCTTTCTTGG-3′；下游：5′-AGAAGATGCTGGTGAACTGATTGATG-3′。β-actin引物：上游：5′-GGCATCCACGAAACTACCTT-3′；下游：5′-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′。定量PCR反应体系：2×SYBR 10 μl，上下游引物各2 μl，cDNA 2 μl ，DEPC水补足20 μl。PCR反应条件：①94℃预变性2 min②94℃变性15 sec③60℃退火30 sec④72℃延伸30 sec⑤扩增40循环次数⑥72℃延伸加时10 min⑦4℃保存。以2-ΔΔCt值进行相对定量。

1.3 数据处理

2 结果

2.1 颅咽管瘤影像学资料

颅咽管瘤代表性核磁共振资料见图1，图中显示，肿瘤起源于鞍上，肿瘤有不均一强化，囊变，累及下丘脑进入三脑室内，接近中脑。

图1 颅咽管瘤典型影像学表现

2.2 定量PCR检测SSTR2基因在颅咽管瘤组织中的表达

定量PCR结果显示：颅咽管瘤组织和对照组织中SSTR2 mRNA的相对含量分别为0.642和0.242，与对照组相比，SSTR2 mRNA的相对含量明显增强，差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 颅咽管瘤和对照组SSTR2 mRNA相对表达量

aP<0.05，vs control

2.3 SSTR2mRNA在不同颅咽管瘤病理类型中的表达

SSTR2基因在颅咽管瘤两种不同病理类型(AE和SP)中的相对表达量见表2。结果显示：AE类型SSTR2基因表达明显强于SP，其相对含量分别为0.811量分别为表同和0.467量分别为表同，二者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 SSTR2 mRNA在不同颅咽管瘤病理类型中的表达

aP<0.05，vs control

3 讨论

颅咽管正常细胞的癌变过程包含多种信号传导通路的改变，特别是G蛋白耦连信号传导通路的改变，进而引起细胞生物学效应的改变，包括原癌基因的活化和抑癌基因的失活等，因此从信号传导通路方面抑制癌变的发生具有非常重要的临床意义。生长抑素作为一种由体内多种组织产生分泌并且广泛存在的激素，其主要作用抑制垂体生长激素和胃泌素的分泌，也可作为一种神经递质，在人体内起着重要的调节作用，其主要的受体是SSTR[2]。SSTR作为G蛋白耦连信号转导通路的受体，在细胞内外信号传递转换过程中起着不可或缺的作用，既可以通过抑制腺苷酸环化酶-cAMP途径，进而使cAMP的水平降低，从而阻止原癌基因的激活，抑制细胞的增殖，也可以通过MAPK途径使酪氨酸激酶失活，从而阻止细胞的增殖[3]。

本研究运用定量PCR检测颅咽管瘤中SSTR2基因的表达，结果显示颅咽管瘤组织中SSTR2基因表达明显增强，提示生长抑素及其类似物可能对抑制颅咽管瘤细胞的增殖具有显著的效果，奥曲肽等生长抑素类似物药物可能具有不错的疗效，但奥曲肽的治疗需要大剂量服用，且长期服用可能具有副作用，产生耐药性[4]。本实验中，结果也显示釉质上皮型(AE)的SSTR2基因表达明显强于鳞形乳头瘤型(SP)，对于AE型颅咽管瘤的奥曲肽等生长抑素类似物的治疗效果可能优于SP型，但是也不可忽略生长抑素类似物对于SP型颅咽管肿瘤的治疗作用。如果奥曲肽的治疗效果未达到预期的疗效，可采用生长激素抑制物结合奥曲肽的治疗[4]。有研究表明，过表达SSTR2可以对内源性SSTR2表达阳性和阴性的肿瘤具有显著的抑制效果，亦可以考虑SSTR2的转基因治疗[5]。国外之前报道，SSTR与表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)常常在细胞上呈现负相关[6]，EGFR具有酪氨酸蛋白激酶活性，能够刺激细胞的增殖。因此对于肿瘤的治疗，不仅仅只是通过激活SSTR来抑制细胞的增殖，也需要通过提高SSTR的水平来降低EGFR的浓度，从而抵消EGFR的作用。因此对于较低表达SSTR2的SP型颅咽管瘤，可以通过提高SSTR水平的药物或SSTR的转基因来治疗。

此外，有研究显示，采用原子量为177的放射性元素镥(Lu)在螯合剂DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸)的作用下与酪氨酸(Tyr)-奥曲肽相偶联,在合适剂量的情况下，这种通过生长抑素受体介导的放射治疗可以产生不错的抗肿瘤效果，并且对正常组织不会产生较大的毒害作用[7]。而在本实验中，颅咽管瘤的SSTR2水平显著高于对照组织，对该种螯合治疗剂敏感，可能只需较小的剂量便可获得意想不到的疗效，并且也不会像通常的放射性治疗一样对身体造成很大的伤害，有望成为临床上治疗颅咽管瘤的一种新方法。