宫颈鳞癌组织ARMCX1 和MMP-9 表达及临床意义

2020-07-21袁马驰许国富

浙江中西医结合杂志 2020年7期

袁马驰许国富

宫颈鳞癌临床较为常见，发生具有双峰的特征，病变形成与机体基因表达失常有关[1-2]。ARM 重复蛋白家族是肿瘤进展相关的蛋白质，其含有多个Armadillo repeat 结构，在正常机体中极少表达，在肿瘤细胞表达明显上调，对细胞间通信有明显的调节作用[3]。ARM 重复X 连锁蛋白1（ARMCX1）是家族中最早发现的成员，细胞损伤后其分泌增多，对细胞增殖和细胞的迁移有明显的促进作用。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是基质金属蛋白酶中的重要成分，具有显著降解明胶的作用，还能引起IV 型胶原、基底膜的降解，同时对层粘连蛋白有一定的调节作用[4-5]。本研究探讨宫颈鳞癌组织ARMCX1 和MMP-9 表达及其临床意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2013 年1 月—2014 年2 月期间在杭州市第三人民医院和浙江中医药大学附属第二医院确诊为宫颈鳞癌的患者67 例作为观察组，选取同期确诊为子宫肌瘤或子宫腺肌症行子宫全切患者67 例作为对照组。均留取两组的石蜡包埋组织和新鲜冻存组织（-80℃冻存）。本研究经医院伦理委员会审核通过，并取得患者知情同意。

1.2 纳入、排除标准纳入标准∶（1）符合WHO 宫颈癌病理诊断标准及分型；（2）术前未接受放疗或化疗；（3）均行宫颈癌切除术+盆腔淋巴结清扫术；（4）有完整的病理资料。排除标准∶（1）转移性鳞癌；（2）双原发癌；（3）生殖系统畸形或发育异常；（4）1 个月内使用过免疫抑制剂。

1.3 主要试剂 ARMCX1、MMP-9、二抗和DAB 均购自苏州睿赢生物技术公司，ARMCX1 （批号RLT0331）和MMP-9（批号RLT1892），均为浓缩液。先行预实验，选择配比浓度ARMCX1（1∶200）和MMP-9（1∶100）显色最理想的浓度用于正式实验。

1.4 免疫组化实验基于石蜡包埋组织，应用免疫组化SP 法检测ARMCX1 和MMP-9 表达，DAB 显色，严格按实验步骤操作。二者的阳性部位是细胞质，以淡黄-棕褐色定为阳性。

1.5 Western blot 实验基于新鲜冻存标本检测ARMCX1 和MMP-9 表达。严格按实验步骤进行蛋白提取、蛋白浓度测定、蛋白变性、加样、电泳、电转膜、免疫杂交后，取出膜后加入发光液，发光2min。将膜取出放入X 胶片盒曝光3min，显影20s。应用Image J 软件进行分析，以目的蛋白与GAPDH 的灰度比值作为相对表达量。

1.7 统计学方法应用SPSS 17.0 进行数据分析，组间率的比较行卡方检验，两组间定量资料的比较行配对t 检验和独立样本t 检验，多组间比较行方差分析，并应用Pearson 相关分析和K-M 生存分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较观察组患者年龄31～86（45.1±6.3）岁，体质量42～87（55.1±10.5）kg，身高135～185（165.8±16.7）cm；病程1～4（2.1±0.3）个月。对照组年龄38～78（46.2±6.1）岁，体质量41～80（54.7±13.4）kg，身高139～182（164.2±17.4）cm；病程1～4（1.8±0.2）个月。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 免疫组化结果 ARMCX1 蛋白定位于宫颈鳞癌的细胞浆和细胞膜，部分强表达的肿瘤在细胞核也能观察到，均染成棕黄色，本组共65 例呈强阳性，2 例呈弱阳性。MMP-9 蛋白定位于宫颈鳞癌细胞的细胞浆和细胞膜，均染成棕黄色。ARMCX1 和MMP-9 在正常宫颈鳞状上皮均不表达。见插页图1-4。

2.3 Western blot 法检测两组ARMCX1 和MMP-9蛋白表达量比较两组ARMCX1 和MMP-9 表达量差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1、插页图5。

表1 两组ARMCX1 和MMP-9 表达量比较（）

注∶观察组为宫颈鳞癌患者；对照组为子宫肌瘤或子宫腺肌症患者；ARMCX1 为ARM 重复X 连锁蛋白1；MMP-9 为基质金属蛋白酶-9

2.4 流式细胞检测两组ARMCX1 和MMP-9 表达量比较两组ARMCX1 和MMP-9 表达量比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 两组ARMCX1 和MMP-9 表达量比较（）

注∶观察组为宫颈鳞癌患者；对照组为子宫肌瘤或子宫腺肌症患者；ARMCX1 为ARM 重复X 连锁蛋白1；MMP-9 为基质金属蛋白酶-9

2.5 观察组不同临床病理特征分组ARMCX1 和MMP-9 表达量比较在不同脉管浸润、病理分型及淋巴结转移分组ARMCX1 和MMP-9 表达量差异有统计学意义（P＜0.05）；不同增殖指数分组ARMCX1表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.6 观察组ARMCX1 和MMP-9 表达相关性分析Pearson 相关性分析显示，ARMCX1 和MMP-9 之间呈正相关性（r=0.43，P=0.034）。

2.7 ARMCX1 和MMP-9 表达生存分析本组随访时间5～60 个月，经K-M 生存分析显示，ARMCX1（χ2=4.36，P=0.032）和MMP-9（χ2=5.02，P=0.013）表达与生存时间相关。见插页图6-7。

3 讨论

宫颈鳞状细胞常由鳞状上皮内病变（低级别和高级别病变）发展而来，与HPV 感染关系密切，最常见的是非角化型。病理形态上显示肿瘤细胞的异型性明显，浸润、侵袭和转移能力强，部分患者预后不良[6]。研究认为，鳞癌发生时多种蛋白表达出现异常，对促进病变进展有明确作用[7]。

ARMCX1 对组织的修复和细胞的分化均具有重要作用。有学者在神经损伤的上皮中观察ARMCX1的表达，认为其对线粒体的运输能力有调控作用[8]。MMP-9 也称为明胶酶B，是经典的促进肿瘤迁移的蛋白，学者认为其在全身的大部分肿瘤中高表达，并能对底物进行溶解，使转移的通路打开[9]。MMP-9 也具有癌基因样的作用，具有促进细胞增殖，减少肿瘤细胞凋亡。由于间质血管新生与肿瘤的形成密切相关，而MMP-9 对间质中CD105 阳性的血管有明显的促进作用[10]。MMP-9 在促进血管生成过程中可能与VEGF 的介导有关[11]。

本研究结果显示，观察组两种蛋白表达高于对照组（P 均＜0.05），提示ARMCX1 和MMP-9 高表达能促进宫颈鳞癌的形成，ARMCX1 和MMP-9 具有癌基因样的肿瘤促进作用。肿瘤组织ARMCX1 和MMP-9 表达与病变的脉管浸润（P＜0.05）和淋巴结转移相关（P＜0.05），提示两者对转移和脉管浸润有促进作用。ARMCX1 和MMP-9 可能是临床判断潜在转移的分子因素。ARMCX1 和MMP-9 与病变的分型有关（P＜0.05），提示两者可能是病理分型的鉴别抗体。临床上非角化型癌的预后差，因此联合检测ARMCX1 和MMP-9 表达可能与预后有一定的关联（P均＜0.05）。生存分析证实ARMCX1 和MMP-9 高表达患者的预后差，因此检测组织ARMCX1 和MMP-9的表达可能是独立的预后指标，这为临床判断肿瘤的生物学行为提供了客观依据。本研究结果还显示，ARMCX1 表达与增殖指数有关（P＜0.05），提示ARMCX1 可能对促进细胞增殖有重要意义。ARMCX1 和MMP-9 具有正相关性（P＜0.05），提示二者具有正向协同作用。ARMCX1 可能是上游基因，调节MMP-9的表达，促进明胶、基底膜、IV 型胶原及层粘连蛋白的溶解，加速肿瘤性病变的进展。ARMCX1 对增殖和迁移的作用可能是间接的[12]。ARMCX1 分泌增加，引起肿瘤细胞生长和分化，肿瘤处于进展期[13]。MMP-9还可能是干细胞分化和调控的重要基因，如对细胞从幼稚向成熟分化，粘附分子的激活等。缺氧诱导因子也能激活MMP-9 的表达，对促进其分泌及功能有调节作用[14]。

表3 观察组不同临床病理特征分组ARMCX1 和MMP-9 表达量比较（）