肛周脓肿和肛瘘组织TNF-α、IL-4 表达和意义

李良飞 金永军 张秀峰 沈 忠

肛瘘是肛周皮肤与直肠肛管之间的慢性感染性病理管道。自隐窝理论[1]提出以来，普遍认为其病因主要与肛腺感染有关，并且常于肛周脓肿破溃或切开引流后形成。肛周脓肿、肛瘘的本质是细菌感染引起的炎症反应。促炎因子和抗炎因子之间互相影响、互相拮抗，导致炎症反应发生，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）作为炎症连锁反应的启动因子，是重要的促炎症细胞因子，而白细胞介素-4（interleukin 4，IL-4）是重要的抗炎细胞因子，参与各种炎症反应过程，炎症细胞因子的表达能准确反映出患者局部炎性的严重程度及应急过程[2-3]。本研究探讨肛周脓肿脓肿壁、肛瘘瘘管组织TNF-α、IL-4 表达及意义，报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 2017 年1 月1 日—2017 年12 月31 日在杭州市第三人民医院（安徽医科大学杭州临床学院）住院行手术治疗，经病理确诊肛周脓肿或肛瘘的全部患者资料，根据诊断及病程长短，分为肛周脓肿组、肛瘘病程＜3 个月组、肛瘘病程3～6 个月组、肛瘘病程＞6 个月组，再按照随机数字表法每组抽取30 例，共120 例肛周脓肿、肛瘘患者的临床资料。本研究经医院伦理委员会审核通过。所有患者签署知情同意书。

1.2 纳入标准 （1）首次就诊，术前行肛周B 超或MRI 或CT 明确诊断，且未曾使用过抗生素；（2）评估无明显手术禁忌证；（3）手术取得相应病理标本送检，病理诊断相符，且病理科留存相应标本。

1.3 排除标准 （1）同时伴有炎症性肠病、结直肠肿瘤以及肛周皮肤病等可能会影响研究结果的疾病的患者；（2）同时伴有凝血障碍等血液系统相关疾病患者，伴有心、肺、脑、肝、肾功能不全等严重全身性疾病患者，以及不能配合的患者；（3）为外伤导致的肛周脓肿和肛瘘以及结核杆菌等特异性感染者；（4）妊娠期、产褥期的妇女。

2 方 法

2.1 免疫组化 根据具体分组至病理科收集相应的病理石蜡标本，并由病理科协助切片备用。兔抗人TNF-α 多克隆抗体（货号ab6671、批号GR235155-29）、兔抗人IL-4 多克隆（货号ab9622、批号GR20231-51）购于英国Abcam 公司；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒、免疫组化试剂盒（PV.6000）购于北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组织化学染色采用EnVision 两步法∶脱蜡—水化、热修复—阻断过氧化物酶—磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗—滴加一抗37℃孵育—PBS 浸洗—滴加SP9000 通用型二抗37℃孵育—PBS 浸洗—DAB 显色—苏木素复染—乙醇脱水及透明—中性树胶封片。

2.2 结果判断标准[4]细胞核和（或）细胞浆是TNF-α 阳性表达部位，IL-4 则主要在细胞膜和（或）细胞浆表达阳性（见插页图1-2），呈黄色、棕黄色、棕褐色表达。评分规则根据表达阳性细胞百分比和阳性染色强度综合计分，根据表达阳性细胞百分比标准∶阳性细胞＜5%计0 分，阳性细胞6～25%计1 分，阳性细胞26～50%计2 分，阳性细胞51～75%计3 分，阳性细胞≥76%计4 分。表达阳性染色强度评分标准∶与背景均匀一致的淡黄色或无着色计0 分，呈淡棕黄色计1 分，呈棕黄色计2 分，呈棕褐色计3 分。无染色或者染色强度与背景无差异者为阴性。最终总分为两项得分相加，根据最后得分来判断表达结果∶0 分表示阴性（-），1～2 分表示弱阳性（+），3～4 分表示中度阳性（++），5～7 分表示强阳性（+++），所有结果经2 次重复观察，2 次计分不一致时，则重新观察确认，整个结果判读请2 名副主任医师以上职称的病理科医师协助完成。

2.3 统计学方法 应用SPSS 19.0 软件处理相关数据，计量资料以均数±标准差（） 表示，采用单因素方差分析；计数资料以率表示，免疫组化染色阳性率结果的比较采用χ2检验，对不同病程TNF-α 与IL-4相关性分析则采用Spearman 等级相关检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 四组肛周脓肿、肛瘘患者一般资料比较 肛周脓肿组30 例中，男20 例，女10 例，年龄15～78（38.40±18.15）岁；病程1～15（5.13±2.84）天；吸烟史23 例，饮酒史21 例。肛瘘病程＜3 个月组30 例中，男22 例，女8 例，年龄19～71（39.87±13.65）岁；病程7～81（43.03±26.53）天；吸烟史19 例，饮酒史22 例；单纯性肛瘘24 例，复杂性肛瘘6 例。肛瘘病程3～6 个月组30 例中，男23 例，女7 例，年龄22～68（44.80±15.81）岁；病程3～6（4.57±1.09）个月；吸烟史27 例，饮酒史19 例；单纯性肛瘘20 例，复杂性肛瘘10 例。肛瘘病程＞6 个月组30 例中，男26 例，女4 例，年龄18～68（41.23±12.65）岁；病程0.54～20（2.94±3.92）年；吸烟史25 例，饮酒史23 例；单纯性肛瘘19 例，复杂性肛瘘11 例。四组患者性别、年龄、吸烟史、饮酒史等资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

3.2 四组肛周脓肿、肛瘘患者TNF-α、IL-4 表达阳性率比较 肛周脓肿组、肛瘘病程＜3 个月组、肛瘘病程3～6 个月组和肛瘘病程＞6 个月组TNF-α 表达阳性率分别为80%、90%、83%、73%，组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组两两比较，肛周脓肿组与肛瘘病程3～6 个月组TNF-α 表达阳性率差异有统计学意义（P＜0.05），其余组间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）。肛周脓肿组、肛瘘病程＜3 个月组、肛瘘病程3～6 个月组和肛瘘病程＞6 个月组IL-4表达阳性率分别为70%、83%、63%、50%，组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组两两比较，肛瘘病程＜3 个月组与肛瘘病程＞6 个月组IL-4 表达阳性率差异有统计学意义（P＜0.05），其余组间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1-2，插页图1-2）。TNF-α、IL-4 阳性表达至顶峰后均呈下降趋势，IL-4阳性表达率低于TNF-α，见插页图3。

3.3 肛周脓肿、不同病程肛瘘组织TNF-α 与IL-4表达相关性 不同病程阶段TNF-α、IL-4 阳性表达的相关性进行分析结果显示，在不同病程阶段TNFα 和IL-4 表达呈正相关（r=0.707，P＜0.05），见表3。

4 讨论

肛周脓肿和肛瘘是发生于肛周的急慢性化脓感染性疾病，两者属于肛周间隙化脓性感染的不同病理阶段，急性期表现为肛周脓肿，随着病情进展导致脓肿破溃、处理不当以及急诊脓肿切开引流，都可能进一步形成肛瘘[5]。

表1 肛周脓肿、不同病程肛瘘组织TNF-α 表达阳性率比较

表2 肛周脓肿、不同病程肛瘘组织IL-4 表达阳性率比较

表3 肛周脓肿、肛瘘组织TNF-a、IL-4 阳性表达的相关性

肛周脓肿和肛瘘的本质都是细菌感染，主要表现为局部炎症反应。有相关研究发现，在大多数的肛瘘瘘管病理标本中可检测到肉芽组织（75%），而肉芽组织提示局部往往有炎症反应[6-8]。另有研究表明，局部细菌入侵的直接损害一般主要表现在病程急性期，在肛瘘瘘管中，难以检测到活细菌，但抗菌肽、细菌残留物、炎症细胞因子（如TNF-α、IL-1β）等细菌成分或炎症介质可被检测到[9-11]。

促炎因子和抗炎因子的相互作用是炎症反应的特点，促炎因子主要有TNF-α、IL-6、IL-1 等，后者主要有IL-4、IL-10、IL-13 等[12-13]。TNF-α 主要来源于激活的单核细胞或巨噬细胞、T 淋巴细胞，一般被认为是炎症反应的始发因子。TNF-α 可增加中性粒细胞聚集，促进下级细胞因子的释放，如促进IL-6、IL-1、氧自由基及IL-8 等炎症因子的释放，从而导致炎症反应放大、递增[2]。IL-4 是常见的抗炎细胞因子，由活化的CD4+细胞、肥大细胞和嗜碱性合成分泌，IL-4 是标志性的辅助性T 细胞2（Th2）细胞因子，可诱导B 淋巴细胞增殖和分化，参与炎症细胞（如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等）的趋化和聚集过程，主要与免疫抑制有关，影响炎症反应主要是通过抑制辅助性T 细胞1（Th1 细胞）分泌相关促炎因子来达到抑制炎症反应的效果[3]。

本研究结果显示，TNF-α、IL-4 在肛周脓肿和不同病程肛瘘中均有超过50%的阳性表达率，在脓肿急性期或肛瘘病程较短时期，局部炎症反应明显，炎症因子的阳性率都达到70%以上，与相关研究结果一致[14]。本研究发现在肛周脓肿及肛瘘病程＜3 个月时TNF-α 表达阳性率呈升高趋势，与临床上有明显不适症状的时期相符合，提示炎症因子引发的组织炎症反应在肛周脓肿和肛瘘的发生、发展中起作用。而且TNF-α 在脓肿期与肛瘘病程3～6 个月期的阳性表达有差异（P＜0.05），表明促炎因子的变化与疾病病程有关。当进入慢性炎症时，TNF-α 在组织中的阳性表达呈下降趋势，这是因为，促炎因子刺激导致抗炎因子被激活产生，从而拮抗促炎因子的毒副反应，使局部炎症反应减轻，细胞因子达到平衡。在本研究中，抗炎因子IL-4 的表达阳性率与TNF-α 的变化趋势相似，都是在脓肿急性期及肛瘘病程＜3 个月时表达阳性率最高，在病程较长的组织中检测到IL-4 表达水平呈下降变化。在进一步分析TNF-α 与IL-4 阳性表达的相关性时发现，两者的阳性表达呈正相关，说明在肛周脓肿、肛瘘的病程进展中，TNFα 和IL-4 相互影响、相互拮抗，二者对肛周脓肿和肛瘘的发生和发展都发挥着重要的作用。

在炎症反应过程中，由于促炎因子和抗炎因子表达强度的不同，导致炎症反应的转归亦不同，当前者占据主导地位时组织炎症反应往往会加重，而当后者表达增加时，疾病则会趋于好转。在肛周脓肿急性期中，细菌入侵，炎症细胞被激活，使得促炎因子TNF-α 大量表达，导致组织炎症加重，加重局部组织损伤，当TNF-α 迅速表达，必然会引起抗炎因子的释放，拮抗促炎作用，而随着炎症反应趋向平缓，两者的表达都会达到平顶峰台期，使得炎症反应向有利于组织恢复痊愈的方向发展，这也符合炎症反应随时间变化而变化的规律[15]。本研究发现，虽然IL-4在肛周脓肿和肛瘘病程前期的表达呈上升趋势，但其阳性表达的上升幅度不及TNF-α 明显，而且在病程中后期的表达呈明显下降趋势，难以拮抗促炎因子的致炎作用。抗炎和促炎的平衡失调，在促炎因子迅速表达的同时，抗炎因子却表达的上升强度不足，致使局部炎症反应持续反复存在，不能完全拮抗和抑制炎症的进一步发展，局部组织损害引起的临床表现呈持续态势，导致肛瘘迁延不愈，这种不平衡的炎症细胞因子表达结果，可能是导致肛周脓肿及肛瘘发生、发展的关键环节。为了打破这一不平衡的趋势，抗TNF-α 受体拮抗剂被相关学者研究，并用于相关炎性疾病的治疗和临床试验，但这些制剂在肛周感染性疾病中应用还需进一步的研究和观察[16]。

综上所述，促炎因子TNF-α 与抗炎因子IL-4在肛周脓肿、肛瘘组织中都有较高的表达阳性率，在肛周脓肿、肛瘘的炎症反应应答中发挥着重要的作用，二者相互影响，相互作用，共同参与肛周脓肿、肛瘘的发生及发展。更多有关炎症细胞因子在肛周脓肿、肛瘘组织中的表达、作用有待进一步的深入研究。（本文已获得第二作者单位授权。）