microRNA调控肝星状细胞活化干预肝癌癌前病变的研究进展

吴 杰，李京涛，魏海梁，闫曙光，范 妤，郭英君，常占杰

1 陕西中医药大学 第一临床医学院，陕西 咸阳 712046；2 陕西中医药大学附属医院 肝病科，陕西 咸阳 712046；3 宁夏回族自治区人民医院 肝病科，银川 750001

肝细胞癌(HCC)是全世界第二大常见的癌症死亡原因，占所有原发性肝恶性肿瘤的90%[1]。过去15年HCC的发病率呈逐年递增趋势，尽管治疗方案不断改进，但患者预后仍然很差，其主要原因是由于多数患者发现时已至晚期，失去最佳治疗时机[2]。临床上，依靠影像学、病理学和分子生物学检测，可以及早的发现肝癌癌前病变的存在[2]。研究[3]证实，在HCC的进展中，会经历一个较长的肝癌癌前病变过程。HCC癌前病变表现为：肝细胞异型增生、异型增生灶、低度异型增生结节、高度异型增生结节、肝细胞腺瘤。如果能够将肝癌的治疗阵线前移，在HCC癌前病变阶段就及早干预，就有可能阻止或延缓癌前病变恶性转变为HCC。

HCC癌前病变恶性转变的机制尚不明确。目前较公认的机制包括肝癌癌前病变细胞的产生(种子破坏)、炎症纤维化微环境的形成(环境污染)，以及两者的相互作用[4]。而在上述机制中，肝星状细胞(HSC)的活化和异常分泌始终处于核心地位，在HCC癌前病变细胞启动、产生以及发展各阶段中，作为异常微环境的特殊组成部分，HSC亦起着关键的作用。本文就microRNA(miRNA)靶向调控HSC活化，干预肝癌癌前病变恶性转变的机制研究新进展进行综述。

1 HSC活化与肝癌癌前病变的关系

1.1 HSC活化 当肝脏受致病因子(病毒、酒精或内毒素等危险因子)损伤时，HSC的邻近细胞(肝窦内皮细胞、Kupffer细胞等)分泌多种细胞因子，这些细胞因子作用于HSC，通过诱导基因转录使HSC基因表达发生改变，HSC会丢失细胞内脂质小滴，转变为成纤维性肌成纤维细胞表型，并表达大量的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和细胞外基质蛋白(ECM)，使其具有自身增殖能力、分泌与调节功能，即活化的HSC[5-6]。活化的HSC通过基质金属蛋白酶抑制剂抑制基质金属蛋白酶活性，导致细胞外基质进一步累积，同时产生大量相关的趋化因子与细胞因子。ECM的过度沉积与细胞因子的大量分泌又进一步刺激活化HSC，如此形成一个正反馈而维持HSC的活性[7]。

1.2 活化的HSC贯穿HCC癌前病变全过程 正常肝细胞的增殖和分化都由细胞内和细胞间信号调控，活化的HSC异常分泌从而干扰正常基因表达、细胞间信号通路传导，使机体细胞组织发生癌变。研究[8]表明，在含有HSC的条件培养基中能显著地诱导肝癌细胞在单层培养皿中的增殖和迁移，在三维球体共培养系统中，HSC促进肝癌的生长，减少中心坏死程度，在裸鼠体内同时植入HSC和HCC细胞可促进肝癌的生长和侵袭，抑制肿瘤坏死。HCC癌前病变细胞的启动阶段,在致病因子持续作用下使肝细胞破坏并向异型增生结节转化[9]。异型增生结节是指在慢性肝炎或肝硬化背景下形成的具有不典型特征的增生结节或团块，存在细胞质和细胞核的异常[10]。与HCC不同，异型增生结节是一种新生的类肿瘤样病变而非单纯的增生性病变[11]。研究[12]表明，高分化异型增生结节患者的端粒酶逆转录酶活性强，推测是因为端粒的长度和结构改变，导致染色体稳定性的改变，进而出现基因突变，而呈现出较高的恶变风险。

在HCC发生发展中，基因组改变是一个逐步累积的过程，持续的基因突变或缺失以及变异基因积累促进异型增生结节的发展[13]。从而加快了启动进程[14]。研究[15]显示，端粒酶逆转录酶启动子的突变频率与p16基因甲基化在肝癌的发生发展中呈明显递增的趋势。在HCC癌前病变细胞的启动阶段中，活化的HSC通过旁分泌产生大量TGFβ，激活TGFβ1-PI3K/AKT信号通路，通过抑制下游抑癌二聚体TSC1/TSC2 活性，调节mRNA的转录，改变肝细胞基因表型，同时活化的HSC可直接分泌免疫调节因子(包括IL-1、IL-6、MCP-1、CCL21等)促进炎症因子的聚集，导致肝细胞非典型增生性修复[16]，从而进一步促进异型增生结节的形成，为肝细胞的恶性转变或肝干细胞转化为HCC癌前病变细胞奠定基础。

在HCC癌前病变细胞的产生阶段，致病因子持续作用与基因变异不断蓄积，逐渐使大量肝细胞与HSC邻近细胞受损，HSC邻近细胞分泌的细胞因子进一步促使更多的HSC活化[17]，大量活化的HSC通过调节胞外基质的降解与合成，降低间质胶原酶活性，减少ECM降解，使大量胞外基质蛋白沉积，ECM被新生的胶原蛋白所取代，加剧炎症因子的浸润，同时，HSC分泌的促炎因子又进一步加重对已损伤肝细胞区域的浸润，受损区域在正反馈调节下促进局部炎性细胞的趋化性、黏附性和活性，进而促使炎症微环境的形成[18]。在炎症微环境下，一方面,低分化异型增生结节更易向高分化异型增生结节转化而加重恶变风险[19]，另一方面，处于有丝分裂期的肝细胞更易发生基因突变，从而干扰了DNA正常复制，导致DNA突变传给子代细胞，肝细胞恶变基因的不断蓄积，最终使肝细胞转化为HCC癌前病变细胞，从而进展为早期肝癌[20-21]。

多数研究者[22]认为在HCC癌前病变细胞的发展阶段，肿瘤细胞具有分化程度差、增殖迅速、易扩散的特点,同时呈浸润性生长。活化的HSC通过调节免疫逃逸，分泌促肝细胞生长因子、促血管生长因子从而使肿瘤细胞直接或间接蔓延侵犯周围正常肝组织。研究[23]发现活化的HSC通过分泌IL-6，诱导发育髓源性抑制细胞的产生，在肿瘤环境中髓源性抑制细胞的高表达使T淋巴细胞免疫反应表现出较强的抑制性，从而增强肿瘤细胞的免疫逃逸能力，有利于HCC的转移和发展。活化的HSC可通过连接 B7-H1/Pd-1信号通路显著增强HSC的免疫调节活性，诱导T淋巴细胞凋亡增强，从而为肝癌细胞的迁移和侵袭创造条件[24]。HSC也可以通过触发HCC细胞的上皮-间质转化分泌层粘连蛋白5[25]，而有研究[26]证实这种层粘连蛋白同工型是具有较强的黏附性及迁移性，更具攻击性和侵害性的癌症表型。活化的HSC作为肿瘤微环境的重要组成部分，其分泌的TGFβ参与肝内结构的重建，通过细胞收缩使肝窦内压升高，为癌变形态学的改变奠定了基础。活化的HSC还通过分泌血管内皮生长因子A与基质金属蛋白酶9增加肝癌细胞血管形成，从而促进肿瘤细胞迁移、瘤体的增长。除此之外，HSC可直接促进HCC细胞的增殖与发展，增强癌细胞的成瘤能力。

因此，活化的HSC在HCC癌前病变恶性转变的全过程中均起到重要作用，是肝癌癌前病变恶性转变防治研究的重要靶点。

2 miRNA与肝癌癌前病变的关系

2.1 miRNA miRNA是指在转录后水平通过负调节基因维持细胞内稳态的非编码RNA，长度约为21 bp，其具有组织特异性小、保守性高、靶基因广的特点。在转录水平下，miRNA通过其自身序列与靶基因之间的特定mRNA碱基配对而下调其靶基因的表达，引起miRNA靶基因的降解或导致蛋白质翻译的变化，从而参与细胞的代谢、增殖、分化以及调亡等生理过程，在疾病的发生发展中发挥着重要的调控作用[27-28]。因miRNA与靶基因具有“一对多”“多对一”的特点，从而使miRNA与靶基因形成复杂的网络结构，这种独特之处使得miRNA能通过信号调节对多种细胞分化过程产生协同作用[29]。基于此，在肝癌癌前病变的发生发展中，相关的miRNA能够通过调控HSC活化而影响这一过程。

2.2 miRNA对HSC活化的调控作用

miRNA在HSC的活化以及癌变进展过程中发挥着重要的作用。miRNA主要通过调控相关靶基因的表达，进而影响HSC状态转化，从而调控HSC增殖与凋亡。

2.2.1 促进HSC活化的miRNA 在HSC活化的进程中，许多miRNA对HSC的活化具有促进作用。Ma等[30]用CCl4诱导肝纤维化大鼠模型，发现肝组织中miRNA-214 水平稳定表达,上调miRNA-214水平可显著降低负调节因子融合同源基因(Sufu)的表达，从而促进Hedgehog信号通路传导，促使HSC增殖、纤维细胞外基质的积累和原纤维基因的表达。TGFβ是肝脏疾病中主要的促纤维化细胞因子。TGFβ与TβRⅡ受体结合导致TβRI受体形成异源四聚体，然后通过Smad2/3的R-Smad磷酸化启动信号通路[31]，磷酸化以后与Smad4结合，然后转移到细胞核内，调节多个目标基因表达[32]，促进HSC的活化。在此过程中，Smad7和R-Smad竞争性与TβRI受体结合，负调节TGFβ信号传导，抑制HSC活化。有研究[33]发现，miRNA-17-5p可通过下调Smad7表达，减少其与R-Smad竞争TβRⅠ受体的结合，进而促进TGFβ信号传导而增强HSC的活化。同时，miRNA-212-3p过表达也可靶向下调抑制性因子Smad7，进而促进TGFβ信号通路，诱导HSC的活化[34]，促进肝纤维化细胞的增殖并抑制其凋亡。研究[35]表明PI3K/AKT通路在促进HSC活化、抑制HSC凋亡充当着重要的角色。TGFβ通过TGFβⅠ型受体直接激活PI3K/AKT通路，miRNA-216a/217簇作为Smad7的抑制剂，通过促进TGFβ信号传导进而激活PI3K/AKT通路，从而促使纤维细胞外基质的积累和癌前基因的表达[36]。研究[37]发现，GNMT是甲基转移的主要调节剂，可抑制甲基化的异常启动子，从而阻止原发性肿瘤的发生，miRNA-873-5p作为GNMT的转录后抑制剂，介导整体表观基因组学改变并促进肝纤维化，同时抗miRNA-873-5p降低STAT3的激活，从而抑制HSC的活化，因此在阻断HCC癌前病变进程中具有重要作用(图1)。

2.2.2 抑制HSC活化的miRNA HSC活化和肝脏炎症反应主要依赖于NF-κB/Bambi信号传导通路的激活，IL-1受体相关激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)和TNF受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)是NF-κB/Bambi信号传导通路的激动剂。研究[38]发现miRNA-146a-5p过表达可特异性抑制HSC活化通路相关的受体激酶与受体因子的激活，从而抑制HSC活化和增殖，减少细胞外基质的沉积，降低肝纤维化的发生与细胞因子的异常分泌，进而延缓癌前病变的进展。

TGFβ通路也可参与抗纤维化调节。Wang等[39]发现miRNA-130a-3p靶向作用于tGfBr1、tGfBr2，从而抑制Smad2 和Smad3磷酸化，阻断TGFβ信号通路从而抑制HSC活化，使HSC活化数量与增殖的标志物α-SMA表达水平下调。锌指蛋白3是肝癌癌前病变中重要的促纤维化基因，miRNA-378a-3p[40]可靶向抑制NF-κB信号通路的Smo下游锌指蛋白3基因的表达，从而抑制HSC的活化。同时，研究[41]证实wnt10a是wnt/β-catenin通路的靶点之一，miRNA-378a-3p过表达可使Wnt/β-catenin途径失活，从而抑制HSC的活化与增殖、α-SMA及胶原的表达。

HSC的活化过程中与TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。TLR4通过其胞内区的TIRAP结构，与MyD88的C端结构域识别并结合，然后依次募集并活化MyD88下游的接头蛋白，包括IRAK4、IRAK1、TRAF6和转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor β-activated kinase-1，TAK1)蛋白，其中，TAK1蛋白既可以激活IKK-NF-κB信号途径，也可以激活p38-NF-κB信号途径，均能促使NF-κB磷酸化并激活，进而活化HSC，增加肝纤维化和炎症反应。研究[42]证实，miRNA-326过表达可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，从而抑制HSC活化，降低癌前相关蛋白的表达水平，增加细胞凋亡。

Kupffer细胞是位于肝窦中的特殊巨噬细胞，活化的M2型Kupffer细胞分泌TGFβ，有效的激活HSC并维持其活性[43]。研究[44]表明，miRNA-155可通过靶向抑制IL-13受体α1来抑制Kupffer细胞向M2型极化，从而减少TGFβ的分泌，除此之外，miRNA-19a-3p通过靶向抑制Far-1而抑制其下游原癌基因Fos，进而抑制M2型Kupffer细胞的极化，减少细胞因子的分泌进而抑制HSC活化[45]。

双荧光素酶报告分析表明[46]，miRNA-185通过直接靶向RHEB和RICTOR的3′UTR降解其mRNA，进而阻断Smad信号与TGFβ的转换，下调α-SMA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原等纤维化相关基因的表达，从而抑制HSC的激活。

研究[47]发现,miRNA-340可以通过抑制SPP1基因进而抑制LX-2细胞活化、降低细胞外基质沉积和增殖,抑制TGFβ1/Smad信号通路激活从而抑制HSC活化,进而影响肝癌癌前病变发生和发展的进程(图2)。

3 小结

肝癌癌前病变的发生与HSC活化密切相关。在肝细胞受损的基础上，HSC活化并释放大量异常信号因子，一方面干扰损伤肝细胞再生修复而发生基因变异，从而促进HCC癌前病变的启动进程，在变异基因不断蓄积之下遗传给子代细胞，并稳定表达，促使肝癌癌前病变细胞的形成；另一方面，大量异常信号因子调控信号通路传导，加剧炎症微环境的形成，促进肝癌癌前病变细胞恶变为肿瘤细胞，并发生扩散，迁移与增长。而miRNA通过与mRNA的3′UTR区结合在转录后水平调节靶基因，干预HSC相关细胞因子的分泌或蛋白基因的表达，影响炎性微环境成分，进而发挥调节HSC活化，影响肝癌癌前病变恶性转变的作用。基于miRNA调控HSC活化干预肝癌癌前病变恶变，将成为肝癌防治工作的新思路和新靶点。