3种跨膜转运蛋白在胆管细胞损伤型药物性肝损伤患者肝组织中的表达特点及意义

叶立红，郑欢伟，黄肖雨，郭立杰，张海丛，刘志权，王翀奎

1 石家庄市第五医院 a.病理科; b.肝病中心; c.药剂科，石家庄 050021；2 河北中医学院 实验中心，石家庄 050200

药物性肝损伤(drug-induced liver injury, DILI)的发病率逐年增加，并且是引起淤胆性肝炎最常见病因。证据表明，胆汁形成、分泌和排流障碍是导致胆汁淤积的主要机制，其中肝细胞胆汁分泌异常是其重要发生机制之一。位于肝细胞毛细胆管膜侧上的3种主要跨膜转运蛋白-ABCB11(胆汁酸盐输出泵，bile salt export pump，BSEP)、ABCC2(多药耐药相关蛋白2，multidrug resistance protein 2，MRP2)和ABCB4(多药耐药糖蛋白3，multidrug resistance associated protein 3，MDR3)对胆汁经肝细胞分泌入毛细胆管发挥了关键作用[1-2]。2015年中华医学会发布的《药物性肝损伤诊治指南》[3]中，王泰龄教授根据药物损伤靶点不同对DILI进行了病理学分类，分为肝细胞损伤型、胆管细胞损伤型、血管内皮细胞损伤型三大类。其中胆管细胞损伤型在病理形态上均表现为毛细胆管胆汁淤积伴/不伴肝细胞胆汁淤积，根据伴有肝细胞坏死程度的不同从病理上又分为3个亚型：混合性肝炎(肝细胞损伤严重)、胆汁淤积性肝炎(肝细胞损伤轻)和单纯性胆汁淤积(无肝细胞损伤)。BSEP、MRP2和MDR3表达异常与多种胆汁淤积性疾病相关，其在上述3种亚型中表达特点如何？是否也存在表达异常？三者表达特点与不同病理形态的胆汁淤积有何关系？以及与血清TBil、DBil、ALP、GGT、TBA水平是否存在相关性？因此，本研究通过对胆管细胞损伤型DILI不同病理亚型的肝组织进行BSEP、MRP2、MDR3免疫组化及病理形态观察，并对比与肝生化指标的相关性，从而探讨转运蛋白在胆管细胞损伤DILI各亚型中的表达特点及在胆汁淤积发生机制中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2010年1月-2017年6月石家庄市第五医院有明确用药史、经肝穿组织病理诊断为胆管细胞损伤型DILI的112例患者的临床资料。根据2015年《药物性肝损伤诊治指南》[3]中的病理分类标准，对入选病例进行明确病理分型，分为混合性肝炎组(混合组，n=40)、胆汁淤积性肝炎(胆汁淤积组,n=40)、单纯性胆汁淤积组(单纯组,n=32)，同时选取20例无胆汁淤积的HBV携带者作为对照组。所有患者均有明确用药史，并排除原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、胆道不全梗阻、酒精性肝病、脂肪性肝炎、嗜肝及非嗜肝病毒感染浩和遗传代谢性疾病等。

1.2 主要试剂与仪器 BSEP(ABCB11)鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，MRP2(ABCC2)兔单克隆抗体、MDR3(ABCB4)兔多克隆抗体购自美国Abcam公司，免疫组化试剂盒(PV-6000)、DAB显色液、抗体稀释液购自北京中杉金桥试剂公司，主要仪器为美智Powerlmager Version5.3图像采集系统、OLYMPUS BX53显微镜及Image-Pro Plus 6.0(IPP)图像分析软件。

1.3 研究方法

1.3.1 肝组织常规病理检测 所有入选病例肝穿标本均常规进行HE染色、网状纤维+Masson染色、淀粉酶消化过碘酸希夫法染色(D-PAS)、CK7/CK19免疫组化染色，病理形态观察由2名经验丰富的病理医师共同阅片并进行各病理亚型分组。

1.3.2 肝组织免疫组化检测及结果判定 所有入选病例均切取3张石蜡切片，分别用于3种抗体的免疫组化标记。免疫组化采用SP法进行严格操作。PBS 代替第一抗体作为阴性对照。由于BSEP、MDR3、MRP2均表达于肝细胞毛细胆管膜侧，因此免疫组化染色以在肝细胞胆管膜上出现棕黄色为阳性表达，无着色为阴性表达。

1.3.3 图像分析软件进行半定量评分 所有切片通过Image-Pro Plus 6.0(IPP)图像分析软件进行半定量分析，图像采集均在完全相同的显微镜条件下拍摄，并对图像分析软件设定统一选色参数。除由于肝细胞坏死消失而造成3种转运蛋白的表达缺失不作为观察区域外，选取组织切片内除坏死区外全部区域进行显微镜下拍照分析。应用图像分析软件分别测量BSEP、MRP2、MDR3在每张切片的阳性区域面积、平均光密度值、积分光密度值(integrated optical density，IOD)，IOD=阳性区域面积×平均光密度值。测量得到IOD数据作为半定量分析的有效指标，并对不同组别间IOD值进行相互比较。

1.3.4 观察指标 所有肝穿标本均进行连续切片，对比观察每例病例组织切片内的病变形态特点(包括肝细胞淤胆、羽毛样变性、毛细胆管淤胆)及BSEP、MRP2、MDR3免疫组化阳性表达变化，并与对照组进行对比分析；收集所有入选病例距肝穿时间最近一次肝生化指标中TBil、DBil、ALP、GGT、TBA值，与BSEP、MRP2、MDR3半定量评分进行相关性分析。

1.4 伦理学审查 本研究方案经石家庄市第五医院伦理委员会审批(批号：SJZWY090112)，所纳入患者均签署知情同意书。

2 结果

2.1 一般资料 混合组40例患者中男18例(45%)，女22例(55%)，平均(45.6±15.4)岁；胆汁淤积组40例患者中男12例(30%)，女28例(70 %)，平均(43.2±15.1)岁；单纯组32例患者中男14例(43.75%)，女18例(56.25%)，平均(47.4±19.0)岁。

2.2 病理形态学特点 混合组：病理形态以中或重度的肝细胞坏死为主，坏死区周围有肝细胞及毛细胆管淤胆、胆栓形成(图1a)。胆汁淤积组：病理形态以胆汁淤积为主，表现为肝细胞明显肿胀、羽毛样变性(胆盐的毒性作用使受损肝细胞明显肿胀、胞浆稀疏呈细网状)，毛细胆管胆栓形成(图1b)。胆汁淤积程度重于混合组，同时伴有轻度肝细胞坏死。单纯组仅表现为中央静脉周围的毛细胆管淤胆、胆栓形成，肝细胞坏死轻微或无(图1c)。

2.3 BSEP、MRP2、MDR3免疫组化表达特点及与病理形态的关系 胆汁淤积组、混合组、单纯组分别与对照组比较，3种转运蛋白在肝细胞膜上表达变化趋势较一致，均表现为阳性表达减少(P值均<0.05)；BSEP、MRP2、MDR3在胆汁淤积组表达减弱较混合组及单纯组更明显，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表1)。BSEP、MRP2、MDR3特异性定位于肝细胞膜，在正常对照组沿肝细胞毛细胆管膜侧呈微管状阳性表达(图2a)。各亚型组BSEP、MRP2、MDR3免疫组化表达特点及与病理形态的关系显示：3种转运蛋白在胆汁淤积肿胀变性及羽毛样变性的肝细胞呈阴性表达(图2b)，在毛细胆管胆汁淤积区沿扩张的毛细胆管壁呈阴性或弱阳性表达(图2c)，其余非胆汁淤积区三者呈现稀疏阳性表达，其中肝细胞胆汁淤积肿胀及羽毛样变性越明显，阳性表达减少越显著。

表1 4组间BSEP、MRP2、MDR3免疫组化IOD均值(取自然对数)的比较

2.4 各组肝生化指标与3种转运蛋白半定量评分的相关性 胆汁淤积组BSEP与TBA值呈中等强度负相关性(r=-0.640，P=0.008)，单纯组MRP2与TBil、DBil值呈中等强度负相关性(r值分别为0.597、-0.643、P值分别为0.019、0.011)(表2)。

3 讨论

肝脏是药物代谢的重要器官，药物诱导的肝内胆汁淤积在临床上较为常见，已知有数百种药物能导致胆汁淤积型DILI的发生[4]。胆汁淤积的发生机制非常复杂，当各种原因引起的胆汁形成、分泌、排泄障碍时均可导致胆汁淤积，其中肝细胞毛细胆管膜上的跨膜转运蛋白功能障碍是造成胆汁分泌异常的重要原因之一。胆汁由肝细胞分泌是一个需要主动耗能的排泌过程, 其分泌的胆汁酸盐及一些非胆汁酸盐的有机阴离子(例如胆红素、磷脂)主要依靠肝细胞毛细胆管膜侧上的3种跨膜转运蛋白BSEP、MRP2和MDR3来共同介导完成[5-6]。这3种转运蛋白为ATP结合盒超家族成员，其表达异常是多种疾病中胆汁淤积的“原发事件”[7]。多数引起胆汁淤积的药物都是ATP结合盒超家族成员反应底物[8]，超家族成员与这类药物反应后会损伤毛细胆管细胞膜上的转运蛋白，从而使胆汁排流障碍导致肝内淤积。BSEP在正常肝细胞中调节胆盐平衡，通过ATP水解将胆汁酸盐逆浓度梯度泵入毛细胆管，是形成毛细胆管内胆汁酸盐依赖性胆汁流的主要驱动力[9]。BSEP表达降低，引起胆汁酸转运及分泌减少，导致肝细胞胆汁酸蓄积，进而对肝细胞造成毒性损害，血清中胆汁酸水平升高。MRP2为有机阴离子的重要转运体，是非胆汁酸盐依赖性胆汁流形成的重要因素，也是唯一将结合胆红素从肝细胞内转运至毛细胆管内的转运蛋白[10-11]。MRP2的表达减少会导致胆红素分泌障碍及胆汁淤积、胆栓形成。MDR3为卵磷脂转运蛋白，负责磷脂的转运。胆汁中的胆汁酸盐、磷脂和胆固醇等主要有机溶质常形成混合微粒，MDR3能有效的将磷脂从双分子层膜内侧移至外侧膜，使胆汁中的胆盐和胆固醇易于形成混合微粒。MDR3表达水平降低会减少卵磷脂的转运，使胆汁中卵磷脂含量下降，胆盐不形成微胶粒，胆盐游离引起胆管细胞损伤，导致胆汁淤积[12]。

既往研究[13-14]显示，某些经胆汁清除的药物或其代谢产物可以通过抑制转运蛋白功能和(或)下调其表达，从而抑制胆汁分泌、胆汁酸运输导致胆汁淤积、高胆红素血症发生，是引起药物性胆汁淤积的发生机制之一。本研究通过观察BSEP、MRP2和MDR3在急性胆管细胞损伤型DILI各亚型肝组织中的表达变化以及与不同胆汁淤积形态改变的关系，结果发现，与对照组比较，3种转运蛋白在胆管细胞损伤型DILI各亚型组肝组织阳性表达减少甚至不表达，尤其以胆汁淤积肿胀及羽毛样变肝细胞明显区阳性表达减少更显著，在毛细胆管胆栓形成的肝细胞胆管膜侧三者表达呈弱表达或缺失，表明3种转运蛋白的表达均受到抑制，从而推测胆汁淤积性DILI发生发展与3种转运蛋白功能或结构受损密切相关；3种跨膜转运蛋白在各亚型组相同肝组织中的表达强弱较一致，表明药物引起的肝细胞或毛细胆管淤胆，不像遗传性胆汁淤积性肝病为单一转运蛋白表达异常，而是会同时影响到3种跨膜转运蛋白表达。各亚型组之间相互比较，胆汁淤积组3种转运蛋白减少程度较混合组及单纯组更明显，尤其以羽毛样变性及肝细胞淤胆肿胀的肝细胞减少为显著，提示胆汁淤积组3种转运蛋白损伤更严重，与胆汁淤积组的肝细胞及毛细胆管淤胆重于其他两组相一致。

TBil、DBil、ALP、GGT、TBA为反映肝脏胆管损伤及胆汁淤积的肝生化指标，通过对各亚型组内3种转运蛋白评分与上述肝生化指标的相关性分析显示，胆汁淤积组BSEP表达评分与TBA峰值呈中等强度负相关性，考虑是与胆汁淤积组肝细胞羽毛样变性较其他两组为多见有关。羽毛样变性是由于胆汁酸盐的毒性作用引起得的受损肝细胞明显肿胀的病理形态改变，负责胆汁酸盐转运的BSEP表达降低后造成肝细胞胆汁酸盐分泌障碍，进而引起血浆中胆汁酸水平升高，因此使得胆汁淤积组BSEP与TBA水平呈负相关性。而混合组和单纯组羽毛样变性相对少见或无，多以毛细胆管淤胆为主要淤胆形态改变，因此两组BSEP与TBA水平无明显相关性。此外，单纯组MRP2评分与TBil、DBil峰值呈中等强度负相关性，MRP2是唯一将胆红素从肝细胞转运至毛细胆管的转运蛋白，其表达减少使得胆红素转运至毛细胆管障碍。单纯组仅有毛细胆管淤胆而无肝细胞坏死，使得影响TBil、DBil升高的因素主要为毛细胆管淤胆，因此MRP2与TBil、DBil呈中等强度负相关性。而胆汁淤积组及混合组除了毛细胆管淤胆引起TBil、DBil升高外，还伴有不同程度的肝细胞坏死，肝细胞坏死亦可引起TBil、DBil升高，使得这两组的TBil、DBil与MRP2无明显相关性。其他肝生化指标与3种转运蛋白免疫组化评分均无明显相关性(P值均>0.05)，这是由于药物引起胆汁淤积的除了药物或其代谢产物抑制3种转运蛋白在肝细胞胆管膜上的表达外，还包括肝细胞和毛细胆管侧微丝微管功能障碍, 细胞膜的流动性、Na+-K+-ATP酶活性等因素[15]，转运蛋白的表达异常并非引起药物性胆汁淤积发生的唯一因素。并且，影响上述肝生化指标升高的因素也不仅包括肝细胞及毛细胆管淤胆，肝细胞炎症坏死、其他各级胆管上皮细胞的损伤亦均可引起上述各指标的升高。

综上所述，3种跨膜转运蛋白BSEP、MDR3、MRP2在胆管细胞损伤型DILI各病理亚型均呈现表达水平降低，提示药物或其代谢产物可损伤毛细胆管膜侧3种跨膜转运蛋白，是胆管细胞损伤型DILI胆汁淤积发生的重要机制之一。