辅酶Q10对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制*

李辉，张一娇，刘津军，卢静，孙莹莹，李燕燕

(1.邯郸市中心医院 心血管内科，河北 邯郸 056004； 2.邯郸市中心医院 生殖医学科，河北 邯郸 056004)

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)损伤是指短时间心肌供血不足或中断一段时间后重新恢复供血，在此过程或造成心肌的损伤[1]。既往研究证实，MI/R可以诱发细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬、线粒体损伤以及氧自由基的过量产生等[2-3]。线粒体自噬在MI/R损伤过程中发挥重要作用，线粒体自噬功能的失调会诱导大鼠MI/R损伤[4]。因此，通过调控大鼠MI/R中线粒体自噬对改善心肌功能具有重要意义。辅酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)是一种脂溶性醌，广泛表达于心脏、肾脏、肝脏及胰等器官[5]。研究发现，临床和动物实验均证明外源性CoQ10可以改善MI/R，对心肌具有一定的保护作用[6]。CoQ10可以通过抑制氧自由基过量产生以及改善心肌细胞线粒体ATP生成等途径保护MI/R造成的心肌组织损伤[7]，但目前有关CoQ10对MI/R的分子作用机制尚不清楚，因此本研究拟通过构建MI/R大鼠模型，探究CoQ10对MI/R的分子作用机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 60只无特定病原体(specific pathogen-free，SPF)级6～8周雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，体质量180～220 g，购自北京大学医学部[SCXK(京)2018-0010]。大鼠置于室温(25 ℃)、相对湿度70%环境下适应性饲养7 d。

1.1.2主要药品与试剂 CoQ10(国药准字H46020107，海南卓泰)，乳酸脱氢酶试剂盒、肌酸激酶、Western blot一抗及二抗稀释液(北京中杉金桥)，心肌肌钙蛋白Ⅰ(上海研辉)，苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE )试剂盒、Beclin-1一抗(Coiled-coil myosin-like Bcl-2-interacting protein，Beclin-1)及细胞色素C氧化酶Ⅳ抗体(cytochrome c oxidase Ⅳ antibody，COX Ⅳ)一抗(江苏碧云天)，自噬微管相关蛋白轻链3(Microtubule associated protein light chain 3，LC3)一抗和p62一抗(美国CST公司)。

1.1.3主要仪器 小动物呼吸机(湖南湘仪，SAR-1000)，高速离心机(美国Thermo Scientific，H1850)，细胞涡旋仪(武汉维塞尔，H22539)，-80 ℃超低温冰箱(青岛海尔，DW-86L578J)，4 ℃、-20 ℃冰箱(合肥美菱，FYL-YS-128)，脱色摇床(江苏盛蓝，H22820)，多功能酶标仪(美国Thermo赛默飞世尔，SuPerMax-3100)，高速台式冷冻离心机(湖南湘仪，SKFH-1600RW)，荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯，NIB900-FL)，Western blot检测装置(美国Bio-Rad，125-0098)，高纯水机(美国Millipore，CSB-20L)。

1.2 方法

1.2.1建模、分组及心率测量 60只SD大鼠随机分为4组，即假手术组(sham组)、假手术+CoQ10组(CoQ10组)、模型组(Model组)及模型+CoQ10组(Model+CoQ10组)，每组15只；采用戊巴比妥钠(75 mg/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定，大鼠心电肢体导联和呼吸机连接，记录Ⅱ导联心电图；开胸暴露心脏分离左侧冠状动脉，sham组和CoQ10组大鼠左冠状动脉前降支只穿线不结扎；Model组和Model+CoQ10组大鼠结扎左冠状动脉前降支约40 min，后松开结扎线再灌注2 h(以缺血时心肌组织变白，心电图ST段抬高，再灌注时心肌变红且ST段下降视为造模成功[8])；CoQ10组和Model+CoQ10组大鼠肌肉注射CoQ10[10 mg/(kg·d)]，sham组和Model组注射等量的生理盐水。记录第7天各组大鼠心率，然后抽取各组大鼠血液并麻醉后处死，手术剪打开大鼠胸腔，剪下心脏组织并放置于液氮罐内保存，待后续实验使用。

1.2.2检测血清乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)和肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)含量 取各组大鼠血液5 mL置于抗凝离心管，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，并按照各试剂盒操作说明书检测大鼠血清中LDH、CK和cTnI含量。

1.2.3氯代三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法检测大鼠心肌梗死面积 取各组大鼠垂直心脏长轴，顺心尖向底部切片；心尖组织切片置于37 ℃、pH 7.4的TTC溶液中染色10 min，4%多聚甲醛固定；观察并计算心肌梗死面积比例[心肌梗死面积=缺血心肌组织(白色区域)面积/正常心肌(红色区域)面积][9]。

1.2.4HE染色 取各组大鼠心尖组织，4%多聚甲醛固定，不同浓度的乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片，依据HE染色试剂盒进行HE染色操作，观察大鼠心肌组织形态学变化。

1.2.5Western blot 检测大鼠心肌组织COX IV、Beclin-1、p62及LC3蛋白 取各组大鼠心尖组织，PBS润洗1～2次，离心，心肌碾磨体积 ∶细胞组织裂解液体积为1 ∶5，冰上裂解1 h；4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液，采用BCA法测定蛋白质浓度；80 V凝胶电泳30 min，转120 V、60 min至溴酚蓝指示电泳至凝胶最底层，依据蛋白质指示marker和目的蛋白分子量大小进行切胶，湿转转膜法将目的蛋白转移至PVDF膜上，转膜时长2 h，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育对应一抗COX Ⅳ(1 ∶1 000)、Beclin-1一抗(1 ∶500)、p62一抗(1 ∶1 000)和LC3(1 ∶1 000)4 ℃过夜，按照1 ∶5 000稀释比例，室温孵育对应的鼠二抗和兔二抗1 h；摇床摇晃加TPBS洗涤3次，5 min/次，加显影液显影并拍照，显影结果以各目标条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。

1.2.6电镜观察大鼠心肌线粒体形态及自噬小体 将各组大鼠包埋的心尖组织采用超薄切片机进行切片，厚度100 nm，经醋酸双氧铀和柠檬铅染色，透射电子显微镜观察心肌线粒体形态以及自噬小体并对其拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 心肌功能

sham组与CoQ10组大鼠血清LDH、CK、cTnI、心肌梗死面积及心率比较，差异无统计学意义(P>0.05);与sham组相比较，Model组大鼠血清LDH、CK、cTnI及心肌梗死面积均值均明显增加，但心率均值明显降低(P<0.01)；与Model组比较，Model+CoQ10组大鼠血清LDH、CK、cTnI及心肌梗死面积均值均降低，但心率均值升高(P<0.05或P<0.01)。见表1。

2.2 心肌组织学改变

HE染色结果显示，与sham组相比，CoQ10组大鼠心肌组织无明显的病理学改变，Model组大鼠心肌组织呈病理学改变，心肌纤维排列不规则，有明显的水肿现象，心肌组织间隙变大等；与Model组相比，Mode+CoQ10组大鼠心肌组织损伤得到明显的改善，心肌纤维排列相对规则，水肿现象减轻。见图1。

表1 各组大鼠血清酶、心肌梗死面积及心率比较Tab.1 Effect of CoQ10 on myocardial function in each

图1 各组大鼠心肌组织的形态学变化(HE，×200)Fig.1 Morphological changes of myocardial tissue in each group(HE，×200)

2.3 大鼠线粒体自噬相关蛋白的表达

Western blot结果显示，与sham组相比，CoQ10组大鼠心肌组织线粒体自噬相关蛋白表达无显著性影响，Model组大鼠心肌组织COX Ⅳ、Beclin-1及LC3蛋白表达均上调，p62蛋白表达下调，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与Model组相比较，Model+CoQ10组大鼠心肌组织COX Ⅳ、Beclin-1和LC3蛋白表达下调，p62蛋白表达均上调，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图2。

注：与sham组相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；与Model组相比，(3)P<0.05，(4)P<0.01。图2 各组大鼠心肌组织线粒体自噬相关蛋白的表达(Western blot)Fig.2 Effect of CoQ10 on the expression of mitochondrial autophagy-related proteins in each group(Western blot)

2.4 线粒体自噬的形态学变化

透射电镜结果显示，与sham组相比，CoQ10组大鼠心肌组织线粒体形态学及自噬小体数量无明显改变，Model组大鼠线粒体内自噬小体数目则显著增加；与Model组相比，Model+CoQ10组大鼠心肌组织线粒体内自噬小体数目减少。见图3。

3 讨论

冠心病心肌梗死是一种严重威胁人类健康的心血管疾病，如何有效的防治冠心病心肌梗死是目前医学界迫切需要解决的难题[10]。MI/R是指机体组织或器官经过一段时间的缺血缺氧之后恢复血流再灌注，组织或器官没有好转反而加重的情况[11]。线体损伤是MI/R中的一种重要表现[12]。心肌细胞的正常功能维持需要消耗大量的ATP，机体中的线粒体则是心肌细胞中含量最高的细胞器[13]。研究表明，在I/R或者心肌细胞H/R时均会导致线粒体功能的障碍，如活性氧的生成增多，线粒体膜电位的除极化以及通透性转换孔的开放等[14]。损伤的细胞器需及时被清理以保证机体的正常生命活动，但在线粒体功能障碍时会诱发自噬的激活或抑制[15-18]。因此，通过寻找有效药物治疗MI/R诱发的线粒体功能障碍至关重要。

注：箭头表示线粒体自噬。图3 各组大鼠心肌组织线粒体的形态学变化及自噬小体数量(400×)Fig.3 Transmission electron microscope observation of mitochondrial morphological changes and the number of autophagosomes in each group(400×)

CoQ10是一种脂溶性抗氧化剂，能够通过清除自由基，降低机体氧化应激反应[19]。目前CoQ10被广泛用于心肌病、心肌炎、心力衰竭等疾病的治疗，也被广泛应用于生殖领域，其抗氧化作用可显著改善患者卵巢功能，提高辅助生殖助孕成功率[20-21]。在高糖诱导的脐静脉内皮细胞凋亡中，CoQ10能够有效降低细胞活性氧的产生抑制内皮细胞凋亡[22]。CoQ10能够通过抑制氧化应激，改善细胞线粒体功能障碍[23]。在血吸虫诱导的肝脏损伤中，CoQ10能够有效治疗血吸虫诱发的肝损伤，其机制涉及降低肝脏氧化应激，保护线粒体功能[24]。CoQ10能够降低大鼠黑质细胞凋亡，改善PD大鼠黑质细胞损伤[25]。以上研究均表明，CoQ10能够有效通过降低细胞氧化应激，改善线粒体功能，进而保护机体和组织免受损伤。但是，目前有关CoQ10对大鼠MI/R的保护作用机制尚不完全明确。因此，本研究通过构建大鼠MI/R模型，探究CoQ10的保护作用机制。结果显示，缺血45 min再灌注2 h后，Model组大鼠血清LDH、CK及cTnI含量明显增加，梗死面积增大，心率降低；给予CoQ10注射后可以降低LDH、CK及cTnI含量，降低梗死面积，升高心率，这些表明CoQ10能够改善MI/R心肌损伤。HE染色结果显示，Model组大鼠心肌纤维排列紊乱，心肌组织出现严重水肿，心肌间隙变大；Model+CoQ10组大鼠心肌组织损伤得到改善，心肌纤维排列相对规则。为进一步探究CoQ10对IM/R的作用，本研究采用Western blot检测了线粒体自噬相关蛋白表达变化，结果显示Model组大鼠心肌组织COXI、COX IV及LC3升高，p62降低；肌肉注射CoQ10可以显著抑制上述相关蛋白的表达变化，改善心肌功能。在通过投射电镜观察心肌线粒体结构以及自噬小体数量发现，与sham组相比，Model组大鼠线粒体结构紊乱，自噬小体数量增多；与Model组相比，Model+CoQ10组大鼠线粒体膜结构有所改善，功能得到改善，自噬小体数量减少。

综上所述，CoQ10可能通过调控线粒体自噬进而保护MI/R心肌损伤。后续为更加深入的认识CoQ10对线粒体自噬的调控分子机制需要进一步研究，可通过体外培养心肌细胞，探讨CoQ10是通过作用何种靶分子调控线粒体自噬，进而为CoQ10治疗IM/R提供理论基础。