良附滴丸抗大鼠乙醇型胃溃疡预防作用及机制*

潘洁，李莉娜，李勇军，曹闯，郭振虎，陆苑**

(1.贵州医科大学 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 贵州省药物制剂重点实验室 & 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550004； 4.贵州黄果树立爽药业有限公司，贵州 贵阳 550008)

随着生活节奏加快及饮食习惯的改变，胃溃疡的发病率有逐年上升的趋势，由于胃溃疡起病缓慢、病程时间较长、难以完全治愈和复发率较高等特点，对患者的身心健康及生活质量均造成不利影响[1]。良附滴丸以良附丸(水丸)为基础，利用现代固体分散体技术将高良姜和醋香附提取浓缩制成，主要用于治疗有寒凝气滞、脘腹胀满、疼痛吐酸等症状的急慢性胃炎、胃溃疡、胃痉挛等[2-4]。由于良附滴丸是经提取浓缩等工序处理后的产品，其物质效应基础有别于良附丸[5]，目前有关良附滴丸抗胃溃疡作用及其机制未见报道。本实验旨在研究良附滴丸抗胃溃疡的作用及可能的作用机理，为良附滴丸的临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1药品及试剂 良附滴丸样品由贵州黄果树立爽药业有限公司提供；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(A001-3)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(A003-1)、一氧化氮(nitric oxide，NO)试剂盒(A012)、BCA法蛋白试剂盒(A045-4)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、前列腺素(prostaglandin，PGE2)试剂盒均为ELISA试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；奥美拉唑肠溶胶囊为悦康药业集团有限公司提供，编号14370930，无水乙醇为分析纯。

1.1.2仪器与设备 酶标仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)、CO2培养箱(美国Thermo)、METTLER AE240天平(梅特勒-脱利多仪器上海有限公司)、紫外分光光度计UV-2401PC(日本岛津)、超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)、78DZF-6050真空干燥箱(上海博讯有限公司医疗设备厂)、IMS-20全自动雪花制冰机(常熟市雪科电器有限公司)。

1.1.3动物 SD大鼠(210～230 g)由贵州医科大学实验动物管理中心购进，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号为SCXK(辽)2015-0001。大鼠在12 h光照/黑暗循环下，在环境受控条件[(22±2)℃，相对湿度(50±5)%]下自由饮水。

1.2 方法

1.2.1动物分组与给药 SD大鼠，雌雄各半，随机分为6组，分别为良附滴丸(低、中、高)剂量组、奥美拉唑组、模型组以及空白对照组，每组8只。低、中、高剂量组分别灌胃良附滴丸良附滴丸[剂量0.27 g/(kg·d)、0.54 g/(kg·d)、1.08 g/(kg·d)]，奥美拉唑组灌胃奥美拉唑[18 mg/(kg·d)]、模型组和空白组给予等体积生理盐水灌胃，连续给药5 d，每天给药1次。第5天给药后禁食不禁水24 h，再给药1次，1 h后除空白对照组外各组灌胃给予无水乙醇(5 mL/kg)[6]诱导溃疡，1 h后将大鼠处死。

1.2.2胃组织学观察、溃疡指数及溃疡抑制率 各组大鼠造模后，取出胃，沿胃大弯剪开，用冰生理盐水冲洗胃组织内容物，用滤纸将水吸干，观察各组大鼠胃组织形态并拍照；以游标卡尺测定病灶长度和宽度，并计算溃疡指数及溃疡抑制率。将胃组织置于福尔马林中固定24 h，进行组织病理切片检测。(1)溃疡指数的计分：Guth[7]标准稍加改良，评定损伤指数；病灶长度≤1 mm计为1分，1～3 mm计2分，2～3 mm计3分，3～4 mm计4分；如果病灶长度>4 mm，将其分成若干段，每段按上述方法记分；当病灶宽度>2 mm时，得分加倍。(2)溃疡抑制百分率= (模型组溃疡指数-给药组溃疡指数)/模型组溃疡指数×100%，每组取平均数。胃溃疡指数评价胃黏膜损伤的程度，溃疡抑制百分率表示某种治疗药物对溃疡或黏膜损伤的修复效果，抑制率越高，则说明药物的治疗效果越好。

1.2.3胃组织SOD、MDA及NO测定 将胃组织用冰生理盐水冲洗净内容物后，滤纸吸干表面水分，将胃平面展开，剪碎，加冰生理盐水制成10%胃组织匀浆液，4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min，取上清液，按照相应试剂盒方法测定胃组织SOD、MDA以及NO含量。

1.2.4胃组织PGE2、TNF-α及IL-6测定 分别取各组10%胃组织匀浆液上清液50 μL，按ELISA试剂盒方法测定PGE2、TNF-α、IL-6含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠胃组织表观及组织学观察

空白对照组胃组织表面光滑，无出血和糜烂情况。与空白对照组比较，模型组在给予无水乙醇诱导胃溃疡后，胃组织表面皱缩明显，大面积出血和糜烂严重，且形成了较密集的黑色条带形溃疡；良附滴丸低剂量组大鼠胃组织表面溃疡和糜烂情况有轻微缓解，但仍伴有严重出血和轻微糜烂，良附滴丸中、高剂量组和奥美拉唑组大鼠胃组织表面各种情况均有较大改善。见图1。正常对照组大鼠胃组织结构清晰可见，黏膜未见明显炎细胞浸润和特殊病变；而模型组胃组织重度水肿，黏膜系中度糜烂，重度血管扩张充血、出血，伴有少量炎细胞浸润；给予奥美拉唑组和不同剂量的良附滴丸组大鼠胃组织上述情况均明显改善，见图2。

注：A为空白对照组，B为模型组，C为奥美拉唑组，D为良附滴丸低剂量组，E为良附滴丸中剂量组，F为良附滴丸高剂量组。图1 各组大鼠胃组织表观形态特征Fig.1 The effect of liangfu dropping pills on the morphological characteristics of rat gastric tissues

注：A为空白对照组，B为模型组，C为奥美拉唑组，D为良附滴丸低剂量组，E为良附滴丸中剂量组，F为良附滴丸高剂量组。图2 各组大鼠胃组织组织形态(HE，×200)Fig.2 The effect of liangfu dropping pills on histopathology of gastric tissues(HE，×200)

2.2 胃溃疡指数、溃疡抑制百分率

与空白对照组比较，模型组的溃疡指数增大(P<0.05)，表明无水乙醇诱导胃溃疡模型建立成功。与模型组比较，良附滴丸高、中剂量组和奥美拉唑溃疡指数降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠胃溃疡指数及溃疡抑制百分率Tab.1 The effect of liangfu dropping pills on gastric ulcer indexes and ulcer inhibition percentages

2.3 胃组织中SOD活力及MDA、NO水平

与模型组比较，良附滴丸低、中、高剂量组和奥美拉唑组大鼠胃组织SOD活力以及NO含量升高(P<0.05或P<0.01)，其中良附滴丸中、高剂量组效果较明显(P<0.01)；良附滴丸中、高剂量组和奥美拉唑组MDA含量降低(P<0.05)，而良附滴丸低剂量组MDA含量与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠胃组织中SOD活力及MDA、NO水平Tab.2 The effect of liangfu dropping pills on SOD activity, the levels of MDA and NO

2.4 胃组织匀浆中TNF-α、PEG2及IL-6水平

与模型组比较，良附滴丸组低、中、高剂量及奥美拉唑组大鼠胃组织匀浆中TNF-α、IL-6含量均降低(P<0.05或P<0.01)；良附滴丸中、高剂量组和奥美拉唑组PGE2含量明显升高(P<0.01)，而良附滴丸低剂量组PGE2含量与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

3 讨论

胃溃疡是一种临床常见多发病，位于贲门和幽门之间，胃腔内消化物质对胃黏膜进行自身消化和侵蚀，导致胃黏膜的攻击因子和防御因子不平衡，使得胃黏膜攻击因子的增强和防御因子的减弱都会引起胃黏膜的损伤[8-9]。患者常表现出一定程度的胃脘痛、嗳气、反酸、恶心呕吐等症状，严重者可出现呕血、休克[10]。由于胃溃疡典型的临床症状表现为上腹部及胃脘部剑突下近心窝处疼痛，故传统医学根据其病症将其归类于 “胃脘痛”、“腹痛”、 “心痛”或者“痞满”等疾病领域[11]。

表3 各组大鼠胃组织匀浆中PEG2、TNF-α及IL-6水平Tab.3 The effect of Liangfu dropping pills on PEG2, TNF-α and IL-6 in gastric

药理学研究表明，胃黏膜除了易遭到H+攻击(酸腐蚀)外，活性氧ROS在代谢过程中对胃黏膜亦发挥了重要的损伤作用，是破坏胃黏膜防御功能、导致溃疡形成的重要因素[12]。而胃黏膜屏障对保持胃黏膜完整和不受损伤具有重要作用，能防止胃腔内的H+向黏膜内扩散，合成并释放前列腺素，从而保护胃黏膜，其主要的代谢途径为：在SOD催化下生成H2O2，再进一步被谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 或过氧化氢酶(CAT)氧化成H2O和CO2，因此，胃黏膜损伤加重与SOD活性降低有关[12-13]。SOD活性可直接反映机体清除ROS的能力，也体现了机体抗氧化保护系统的功能；ROS可以攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化的产物MDA，故MDA含量可间接反映机体受自由基攻击的严重程度[14-15]。NO作为一种内源性血管舒张因子，能调节胃酸和胃黏液分泌及碳酸氢盐生成，可有效舒张血管，增加胃黏膜血流量，从而在维持黏膜完整性和黏膜防御中直接发挥作用[16-17]。TNF-α是一种重要的致炎因子，能促进T细胞产生各种炎症因子(IL-6、TNF- α、PGs等)相继释放，诱导中性粒细胞活化，释放过氧化物酶，造成胃黏膜内皮细胞的损伤，使血流减少，影响胃黏膜血氧供给，加剧损伤，进而促进炎症反应的生成[17-19]。PGE2是胃黏膜极为重要的防御因子，主要生理作用是抑制胃酸分泌，抑制胃液中蛋白水解酶的活性，增加碳酸氢盐和胃酸的分泌，增强胃黏膜血流，保持黏膜血管结构完整性，改善黏膜血液循环，从而保护胃黏膜；此外，PGE2能够调节TNF-α合成和释放，可明显降低TNF-α的表达[16,20]。因此，良附滴丸抗无水乙醇诱导的胃溃疡作用可能与上述胃黏膜保护因子和炎症介质的增加和减弱有关。

本实验给药剂量经人的临床剂量换算而来，以人鼠换算因子6.3计，人体质量70 kg进行转换得到良附滴丸大鼠剂量为0.27 g/kg，并经前期剂量确认发现大鼠临床剂量具有较小程度的胃溃疡修复作用，降低剂量时模型溃疡无明显好转，因此以人临床剂量换算到大鼠的剂量0.27 g/kg为低剂量，低剂量的2倍和4倍分别为中、高剂量。实验结果表明良附滴丸中、高剂量对大鼠胃溃疡具有明显的修复治疗作用。

综上所述，良附滴丸能够显著抑制无水乙醇引起的急性胃黏膜损伤，良附滴丸不同剂量均能够降低炎症反应介质MDA、TNF-α和IL-6含量的产生；还可以增加机体NO、SOD、PGE2等胃黏膜保护因子的含量，从而增加血流量，以供给大量营养于受损部位，有效改善无水乙醇诱导的胃黏膜损伤。