HPLC测定余甘子茶中3种多酚成分及抗氧化活性研究

刘晓丽,杨冰鑫,陈柳青,雷 源,吴克刚

(广东工业大学轻工化工学院,广州番禺 511400)

余甘子是一种亚热带植物[1],源于缅甸和印度,现在中南半岛、印度尼西亚、菲律宾、中国等地均有分布,其中在中国的产量相对较多,被列为我国“药食同源”的品种之一[2]。余甘子富含多酚、维生素、多糖、有机酸等多种活性物质[3-5],其中最具有特征的成分是多酚,约占余甘子的20%左右,主要有效多酚成分有没食子酸(Gallic acid,GA)、柯里拉京(Corilagin,CO)、鞣花酸(Ellagic acid,EA)等[6-8]。

近几年大量文献报道,余甘子有利肝[9-10]、消炎[11]、降血脂血糖[12-13]、提高机体免疫力[14]、美白[15]、抗糖尿病[16]等生理功效。其中GA、CO和EA的含量常被视为余甘子品质评估的重要指标[17],其具有抗肿瘤、抗氧化等作用[18]。目前,余甘子茶在我国的四川、广东、云南等地均有销售,用其泡茶可有效缓解消化不佳、咽喉不适、血液循环不佳等不良反应[19-20]。据报道,余甘子多酚可以作为抗氧化剂替代品运用于食品的抗氧化;将余甘子多酚作为一种天然油脂抗氧化剂应用于饼干的加工;添加余甘子多酚的产品在贮存过程中的过氧化物值和酸价都明显低于添加人工合成抗氧化剂BHA[21]。余甘子茶中多酚提取方法多样,溶剂浸提法较为普遍使用,其中用乙醇相对于其它溶剂提取效果较佳且无毒。目前在HPLC测定余甘子中多酚活性成分的相关文献中,主要采用的流动相为磷酸溶液-乙腈,这一流动相下梯度洗脱程序较为复杂且耗时较长[22]。

本论文所采用0.1%三氟乙酸-乙腈解决了这一问题。本实验用45%乙醇提取余甘子茶多酚,测定总多酚(Total polyphenols,TP)含量,并对不同产地的余甘子茶提取液进行HPLC分析测定余甘子茶中GA、CO和EA的含量,同时比较其抗氧化活性,为余甘子进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

余甘子茶 分别购自四川凉山、福建漳州、广东潮汕、云南昆明、广西玉林五个不同产地;昆明小鼠许可证号:SCXK(粤)2013-0034 广州中医药大学;无水乙醇、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、无水碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、30%双氧水、水杨酸 均为分析纯,天津市致远化学试剂有限公司;二甲基亚砜(DMSO) 天津致远化学试剂有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH,分析纯)、鞣花酸(EA)、柯里拉京(CO)、没食子酸(GA)(标准品) 上海源叶生物科技有限公司;乙腈 色谱纯,瑞典Opson;2-硫带巴比妥酸、福林酚溶液 均为分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁 均为分析纯,天津市大茂化学试剂;水 为高纯水。

LC-20A高效液相色谱仪、Inertsil ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱 日本岛津;U-1950紫外-可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 供试品溶液的制备 精密称取2 g余甘子茶溶于25 mL的45%乙醇中,在温度为70 ℃的条件下浸提135 min,过滤,滤渣重复上述操作,合并两次滤液后旋转蒸发,浓缩至膏状,浓缩液用DMSO稀释到浓度为0.2 mg/mL,0.45 μm的有机微孔滤头过滤得到滤液。

1.2.2 对照品溶液的制备 分别称取一定量的GA、CO、EA,以DMSO为溶剂,配制GA、CO、EA对照品,浓度均为1 mg/mL,0.45 μm的微孔滤头过滤得到滤液。

1.2.3 TP的测定 参考卜彦花等[23]的福林酚比色法。绘制标准曲线,其中X轴为GA的质量浓度(mg/mL),Y轴为吸光值,得线性方程为:y=0.1431x+0.0791(r=0.9997,1～5 mg/mL),依据标准曲线计算TP含量,用mg 没食子酸/g余甘子茶表示,计算公式如下:

式中,V:总体积(mL);A:GA浓度(mg/mL);m:样品质量(g)。

1.2.4 色谱条件 色谱条件[24]:以Inertsil ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱;柱温为25 ℃,乙腈(A)为0.1%三氟乙酸(B)为流动相流速为1.0 mL/min,进样量1 μL,在254 nm波长处检测,梯度洗脱:0～35 min,95%～68%(B)。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 线性关系考察 分别吸取GA、CO、EA溶液,用DMSO梯度稀释,配制成浓度为 0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 mg/mL的溶液,充分摇匀,在1.2.4色谱条件测定。X轴为标准样品的浓度(mg/mL),Y轴为色谱峰的峰面积(104)。

1.2.5.2 精密性实验 依据1.2.2方法制备的GA、CO、EA溶液,在1.2.4色谱条件下,连续进样6次,计算GA、CO、EA峰面积的标准偏差(RSD)。

1.2.5.3 稳定性实验 依据1.2.1方法制备凉山的余甘子茶提取液,参照1.2.4色谱条件对同一样品在0、2、4、8、10、24 h分别测定,分别计算GA、CO、EA含量的RSD。

1.2.5.4 重复性实验 参照1.2.1方法平行制备6份凉山的余甘子茶提取液,在1.2.4色谱条件下,分别计算GA、CO、EA含量的RSD。

1.2.5.5 加样回收率实验 按照1.2.1方法制备凉山的余甘子茶提取液,加入0.1 mL不同浓度的GA、CO、EA溶液,参照1.2.4色谱条件,分别计算GA、CO、EA加标回收率。

1.2.5.6 样品测定 参照1.2.1方法制备的不同产地的样品溶液,在1.2.4色谱条件,连续进样3次,分别计算余甘子茶中GA、CO、EA含量。

1.2.6 DPPH自由基清除率的测定 DPPH清除自由基的测定方法参考文献[25-26],取3 mL待测液,加3 mL的0.1 mg/mL DPPH-无水乙醇溶液,静置30 min使其充分反应,4000 r/min离心10 min,于517 nm处测其吸光度,以茶多酚为阳性对照。

式中:A1为样品上清液的吸光度;A2为样品加无水乙醇的吸光度;A3为无水乙醇加DPPH溶液的吸光度。

1.2.7 羟自由基清除率的测定 采用水杨酸滴定法[27],取待测样品2 mL,加9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L的C7H9O3溶液各1 mL,再加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL使其发生显色反应,在37 ℃的水浴锅中反应30 min后于510 nm处测其吸光度,以茶多酚为阳性对照。

式中:A1上清液的吸光度;A2为不加H2O2的吸光度;A3为空白液的吸光度。

1.2.8 总还原能力的测定 采用铁氰化钾还原法测定[28]。取1 mL待测液,加pH6.6磷酸缓冲溶液和1% K3[Fe(CN)6]溶液各2.5 mL,50 ℃水浴20 min,再加入10% TCA溶液2.5 mL,4000 r/min离心10 min取上清液2.5 mL,加入2.5 mL的去离子水和0.5 mL的0.1% FeCl3溶液,振动混匀后静置10 min后于700 nm处测吸光度,以茶多酚为阳性对照。

1.2.9 自发性肝脂质氧化的抑制 昆明小鼠处理前禁食禁水12 h,脱臼处死,取其肝脏,用组织捣碎机进行捣碎,混于生理盐水制成5%(m/v)的肝匀浆。采用硫带巴比妥酸显色法[29]进行检测,向1 mL 5%肝匀浆中0.32 mL余甘子茶提取液,37 ℃水浴1.5 h,加入1 mL的EDTA和TCA的混合液(EDTA的浓度为0.1%,TCA的浓度为10%),4000 r/min离心10 min,再加入1 mL的0.67% TBA,沸水浴30 min,在532 nm处测吸光值A2,以加去离子水为空白对照,测得吸光值为A1,以茶多酚为阳性对照。肝脂质氧化抑制率的计算公式为:

表2 加样回收率试验Table 2 Recovery test of sample loading

式中:A1为样品上清液的吸光度;A2为空白对照的吸光度。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 余甘子TP含量

福林酚法测余甘子茶中TP含量的结果见图1,TP含量最高的是凉山的余甘子茶为228 mg/g,最低的是漳州产地为107 mg/g。

图1 不同产地的余甘子中TP的含量Fig.1 Total polyphenol content in Phyllanthus emblica L.in different producing areas

2.2 对照品和余甘子样品的HPLC色谱

从HPLC图能够得出,在1.2.4色谱条件下,余甘子茶提取液色谱图中GA、CO、EA 3个目标峰的分离效果较好,而且各产地样品的目标峰出峰时间与GA、CO、EA出峰时间一致。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系 GA、CO、EA的线性方程、相关系数见表1。在线性范围内,相关系数r均大于0.999,各个标准品的峰面积和浓度之间的线性关系良好。

表1 对照品的线性方程Table 1 Linear equations for control article

2.3.2 精密度实验 GA、CO、EA峰面积的RSD依次为2.52%、2.49%、1.02%,表明仪器有较好的精密度。

2.3.3 稳定性实验 余甘子茶中GA、CO、EA含量的RSD依次为1.38%、2.30%、2.47%,表明在室温条件下,余甘子茶提取液在1 d内稳定性良好。

2.3.4 重复性实验 余甘子茶中GA、CO、EA含量的RSD依次为1.78%、2.66%、2.36%,表明该方法重复性优良。

2.3.5 加样回收率实验 余甘子茶中GA、CO、EA的加标回收率依次为96.82%、97.69%、95.84%,RSD依次为0.48%、0.67%、1.23%。表明方法有较好的回收率且回收结果精确可靠。

2.4 5个产地的余甘子茶提取物中GA、CO、EA含量HPLC方法测试不同产地的余甘子茶中GA、CO、EA含量的结果见表3。在GA、CO、EA三种多酚中,余甘子茶多酚中CO的含量最高,在10 mg/g以上,GA和EA的含量在1～6 mg/g。漳州的余甘茶中GA、CO、EA的含量(5.00、28.76、4.30 mg/g)均高于凉山、昆明、潮汕、玉林产地的余甘茶,玉林的余甘茶中GA和CO最低分别为1.21、13.16 mg/g,昆明的余甘茶中EA含量最低为1.91 mg/g。GA含量从高到低产地依次为:漳州、昆明、凉山、潮汕、玉林;CO含量从高到低产地依次为:漳州、凉山、昆明、潮汕、玉林;EA含量从高到低产地依次为:漳州、潮汕、玉林、凉山、昆明。由此推断,余甘子茶中GA、CO、EA的含量不同可能与余甘子茶的生长地域有关。

图2 对照品和余甘子提取物的HPLC色谱图Fig.2 High performance liquid chromatogram of control and Phyllanthus emblica L.extracts注:1、GA;2、CO;3、EA;4、凉山;5、潮汕;6、昆明;7、玉林;8、漳州;A、GA;B、CO;C、EA。

表3 不同产地的余甘子茶提取物中GA、CO、EA含量Table 3 Contents of GA,CO and EA in ethanol extracts of Phyllanthus emblica L.from different origins

2.5 自由基清除率

2.5.1 不同产地的样品对DPPH·的清除能力 不同产地的样品对DPPH·的清除能力结果见图3。余甘子茶提取物中主要以酚类物质为主,酚类物质中的酚羟基提供电子和DPPH·中的孤对电子有效结合,进而清除DPPH·。当样品浓度为6～62 μg/mL范围内,各产地样品对DPPH·的清除能力随着浓度逐渐增加,漳州的余甘子茶提取液清除能力较差,EC50为24.10 μg/mL,而昆明、玉林、凉山的余甘子茶提取液对DPPH·的清除能力差异不显著(P>0.05),EC50依次为7.25、7.26、7.46 μg/mL。

图3 不同产地的余甘子茶提取物对DPPH自由基的清除率Fig.3 Inhibitory effects of ethanol extracts of Phyllanthus emblica L.from different habitats on DPPH free radicals

2.5.2 不同产地的样品对·OH的清除能力 不同产地的样品对·OH的清除能力结果见图4。余甘子茶提取物的酚羟基作为供电子基团与具有极强吸电子能力的·OH结合,清除·OH。在对·OH清除能力的比较中,当样品浓度在0.4～2 mg/mL范围内时,各产地样品对·OH的清除能力随着浓度逐渐增加,漳州的余甘子茶提取液的清除能力较差,EC50为0.83 mg/mL,凉山的则最好,EC50为0.44 mg/mL;综上所述,在5个不同产地的样品中凉山的余甘子茶提取液对DPPH·和·OH的清除效果较好,漳州较差。

图4 不同产地的余甘子茶提取物对羟基自由基的清除率Fig.4 Inhibitory effect of ethanol extracts of Phyllanthus emblica L.from different habitats on hydroxyl radicals

2.5.3 不同产地样品和标准品对自由基清除能力的EC50不同产地样品和标准品对自由基清除能力的EC50结果见表4。测定GA、CO、EA对DPPH·清除能力,标准品相比于其它产地的余甘子茶,GA和CO相对较好;在被检测的9个样品中GA抑制效果最好，EC50为1.06 μg/mL,茶多酚最差。测定GA、CO、EA对·OH清除能力,相比于其它产地余甘子茶,CO和EA相对较好;在被检测的9个样品中CO清除效果最好，EC50为0.23 mg/mL,GA最差，EC50为8.98 mg/mL。

表4 各样品自由基清除率的EC50Table 4 EC50 of free radical scavenging rate of each sample

2.6 总还原能力

总还原能力可以解释物质抗氧化活性的原理,作为抗氧化能力评价的指标之一[30]。余甘子茶提取物中的酚羟基将K3[Fe(CN)6]中的Fe3+还原成Fe2+,亚铁氰化钾和三氯化铁在酸性条件下生成亚铁氰化铁,在700 nm处有吸收峰,由于不同产地的余甘子茶提取液中多酚含量不同,其吸光值也相同,因此对不同产地的余甘子茶提取物的总还原能力进行比较。各产地余甘子茶提取物的总还原能力见图5。当各样品浓度为0.2～1 mg/mL,随样品浓度增加,总还原能力也呈上升趋势,其中以昆明的余甘子茶提取液总还原能力最强,凉山产地相对较差。

图5 总还原能力Fig.5 Total reduction capability

2.7 自发性肝脂质氧化抑制

肝脂质氧化产生大量的丙二醛及其它醛类物质,丙二醛可与TBA生成有色化合物在532 nm处有吸收峰。各不同产地的余甘子茶提取液对自发性肝脂质氧化的抑制率见图6。不同产地的余甘子茶提取液对自发性肝脂质氧化抑制能力不同,但差异不显著(P>0.05),其中凉山州产地的余甘子茶提取液对自发行肝脂质氧化抑制能力效果最高,各产地的余甘子茶提取液对自发性肝脂质氧化的抑制能力强于茶多酚。

图6 不同产地的余甘子茶提取液 对自发性肝脂质氧化的抑制率Fig.6 The inhibition rate of the extract of Phyllanthus emblica L.in different places on the spontaneous hepatic lipid oxidation注:不同小写字母表示差异显著,P<0.05。

2.8 相关性分析

通过SPSS进行相关性分析,得出活性成分的含量与抗氧化活性的EC50值的相关系数,结果见表5。各活性成分的含量与抗氧化活性的指标具有相关性,且均为正相关。CO的含量和 DPPH·的清除能力相关性极显著(P<0.01),相关系数为0.964,EA的含量和DPPH·的清除能力显著相关(P<0.05),相关系数为0.933;与·OH的清除能力相关性最大的是EA的含量,与总还原能力相关性最大的是GA的含量,GA含量与自发性肝脂质氧化抑制能力具有显著相关性(P<0.05);在这四个活性成分的指标中对抗氧化活性的贡献依次为:CO>EA>GA。多酚具有抗氧化活性主要是因为多酚中含有酚羟基,酚羟基具有还原性,通过自身被氧化从而达到抗氧化的效果,其抗氧化活性的大小与多酚中有效酚羟基的数目之间呈正相关[31],GA、CO、EA三种活性多酚中酚羟基的个数依次为:CO>EA>GA,这与四个指标对抗氧化活性贡献大小的结果是一致的。

表5 活性成分含量与抗氧化活性之间的相关系数(r)Table 5 Correlation between active ingredients and antioxidant activity

3 结论

本实验建立了测定余甘子茶中GA、CO、EA含量的方法,该方法简捷、精准、稳定且重复性好,可用于评价余甘子茶的质量。同时测定了5个产地的余甘子茶中的GA、CO、EA的含量,其中GA的含量以漳州(5.00 mg/g)最高,玉林(1.21 mg/g)最低;CO的含量以漳州(28.76 mg/g)最高,玉林(13.16 mg/g)最低;EA的含量以漳州(4.30 mg/g)最高,昆明(1.91 mg/g)最低。

余甘子茶提取物抗氧化活性研究结果表明,凉山产地样品对DPPH·和·OH的抑制效果较好,漳州的最差;昆明产地样品的总还原能力最好,凉山的最差。余甘子茶中的GA、CO、EA含量与抗氧化活性具有相关性,对抗氧化活性的贡献依次为:CO>EA>GA;其中CO的含量和DPPH·的清除能力相关性极显著(P<0.01,r=0.964),EA的含量和DPPH·的清除能力相关性显著(P<0.05,r=0.933),GA的含量与自发性肝脂质氧化抑制能力相关性显著(P<0.05,r=0.895)。实验结果发现各产地的余甘子茶对肝脂质氧化抑制的能力强于茶多酚,为开发出一种新型保肝药品提供科学依据。同时余甘子茶的抗氧化活性研究为余甘子作为抗氧化剂替代品用于食品的抗氧化,以及进一步开发为功能性食品的添加物提供了理论依据。