分光光度法检测昆仑雪菊总黄酮络合显色体系适应性研究

徐兰英,金 丽,许 引,张艺凡,刘思思,龙 涛

(黄冈师范学院化学化工学院,催化材料及制备湖北省重点实验室,湖北黄冈 438000)

昆仑雪菊是菊科金鸡菊属,学名两色金鸡菊(Coreopsistinctoria,CT)。天然雪菊主要生长在高原,特别是新疆地区海拔3000 m左右的昆仑山脉。在新疆当地,昆仑雪菊不仅可以作为花茶饮料,还被用作治疗高血压和高脂血症的民间药物,被大众普遍认为是具有降血糖[1-5]、降血压[6-9]、抗炎[10-13]、抗衰老等[14-16]功效的传统保健食品,引起研究者广泛关注。

雪菊含有多种植物化学成分,其中黄酮类化合物含量尤为丰富[17-20]。国内外的研究表明,黄酮类化合物具有许多生理活性和药用价值,例如抗氧化作用、癌症预防和抑制炎症及其相关疾病[21-26],昆仑雪菊总黄酮含量的高低是评判其质量优劣的重要指标之一,因此对雪菊总黄酮含量进行准确测定具有重要意义。目前,雪菊总黄酮含量测定主要有NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法、KAc-AlCl3法及三乙胺法。以芦丁为参照物质,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 络合显色反应体系测定时,因雪菊中还含有绿原酸、邻苯二酚等,这些物质均具有邻二酚羟基结构,碱性环境下与铝离子形成络合物,可能会对黄酮的测定造成干扰,影响总黄酮的测定[27]。三乙胺法主要测定雪菊中以芹菜素为母核的黄酮类化合物的含量,测得雪菊中的实际总黄酮含量偏低[28]。本文采用溶剂提取法提取雪菊中的总黄酮,并将总提物分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取得乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物,采用HPLC法筛选适用于雪菊总黄酮含量测定的络合显色体系,建立简单、快速、准确测定昆仑雪菊总黄酮含量的方法,为昆仑雪菊质量控制和综合开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆仑雪菊 吐鲁番市爱丽地亚果业有限责任公司;芦丁、表儿茶素(EC)、槲皮素、黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、奥卡宁 纯度≥98%,南京景竹生物科技有限公司;乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、九水硝酸铝、氯化铝 分析纯,上海国药集团;甲醇、乙腈 色谱级,美国Tedia公司。

UV-1800型紫外-可见分光光度计 岛津科技仪器有限公司;UPT-II-10T 型优普系列超纯水器 成都超纯科技有限公司;KQ-250DB型数控超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司;RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵 河南巩义市予华仪器有限责任公司;101-2AB型电热鼓风干燥箱 天津市泰丝特仪器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;TF-FD-1型冷冻干燥机 上海拓纷机械设备有限公司;AL-206型电子天平 上海梅特勒-托利多公司;1260 II型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 雪菊总黄酮的提取及乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的制备

1.2.1.1 雪菊总黄酮提取液的制备 将干燥的雪菊花粉碎,过60目筛[10],准确称取雪菊粉末1.0 g,共5份,分别置于50 mL圆底烧瓶中,固定料液比为1∶20 (g/mL),用60%乙醇水溶液(V/V)为溶剂回流2 h,冷却后过滤,收集滤液。将滤渣用同样的方法重复提取两次,合并滤液后置于容量瓶,将其定容至100 mL得雪菊总黄酮提取液,置于冰箱中,4 ℃保存备用。

1.2.1.2 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的制备 另取雪菊粉末10.0 g,按1.2.1.1的方法提取后将滤液合并,蒸馏除去乙醇,得到悬浊液,再加适量蒸馏水混匀后,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,分别合并相应的萃取层后,用旋转蒸发仪减压蒸馏,除去溶剂后得雪菊石油醚萃取物0.2 g(油状)、乙酸乙酯萃取物1.2 g和正丁醇萃取物0.8 g,置于冰箱中,4 ℃保存备用。由于石油醚萃取物中主要是非极性挥发油,因此本研究重点讨论EAE及n-BuOH-E萃取物。

1.2.2 总黄酮测定络合显色反应体系考察

1.2.2.1 NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH络合显色反应体系 分别精密称取芦丁、槲皮素、EC各5.0 mg,用甲醇200 W超声5 min辅助溶解后,定容至25 mL,得到质量浓度为0.2 mg/mL标准溶液,置于冰箱中,4 ℃保存待用。

准确移取0.2 mg/mL标准品和雪菊总黄酮提取液各0.30 mL,分别置于10 mL容量瓶中,用70% 的甲醇-水稀释至溶液体积约为5 mL。分别加入0.30 mL质量分数为5% NaNO2溶液,静置5 min,再加入0.30 mL质量分数10%的Al(NO3)3溶液,放置6 min,再加4.0 mL 1 mol/L NaOH溶液,用70%甲醇溶液定容至刻度,摇匀,静置15 min。以70%甲醇为参比溶液,于300～600 nm进行连续波长扫描。将硝酸铝换成氯化铝重复该实验。

1.2.2.2 KAc-Al(NO3)3/AlCl3络合显色反应体系 准确移取0.2 mg/mL标准品和雪菊总黄酮提取液各0.30 mL,分别置于10 mL容量瓶中,用70% 的甲醇-水稀释至溶液体积约为5 mL。分别加入0.1 mol/mL Al(NO3)3溶液2 mL,放置6 min,再加入1 mol/mL KAc溶液3 mL,最后用70%甲醇溶液定容至刻度后混匀,静置15 min。以70%甲醇为参比溶液,于250～600 nm进行连续波长扫描。将硝酸铝换成氯化铝重复该实验。

1.2.3 紫外-可见分光光度法标准曲线的绘制

1.2.3.1 NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH法标准曲线的绘制 分别准确移取标准品溶液0.00、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mL于10 mL容量瓶中,然后按照1.2.2.1中的操作步骤制备待测液,在最大吸收波长处测其吸光度。以标准溶液的质量浓度(x)为横坐标,以吸光度(y)为纵坐标,绘制标准工作曲线。将0.30 mL质量分数10%的Al(NO3)3溶液换成质量分数10%的AlCl3溶液重复该实验。

1.2.3.2 KAc-Al(NO3)3/AlCl3法标准曲线的绘制 分别准确移取标准品溶液0.00、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mL于10 mL容量瓶中,按照1.2.2.2中的操作步骤制备待测液,并测吸光度,以浓度(x)-吸光度(y)绘制工作曲线。将2 mL 0.1 mol/L Al(NO3)3溶液换成0.1 mol/L AlCl3溶液重复该实验。

1.2.4 雪菊EAE和n-BuOH-E层中总黄酮含量测定 分别准确称取5.0 mg EAE和n-BuOH-E萃取物,用40%的甲醇溶解并定容至25 mL,得雪菊乙酸乙酯层、正丁醇层待测液,置于冰箱中,4 ℃保存备用。

1.2.4.1 NaNO2法测雪菊不同萃取层总黄酮含量 分别准确移取0.30 mL EAE和n-BuOH-E层待测液各两份于10 mL容量瓶中,分别加入70%的甲醇-水溶液稀释至溶液体积为5 mL,再按照1.2.2.1中的操作步骤制备待测液并测吸光度。将510 nm处的吸光度值分别代入芦丁NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH法两条标准曲线方程计算总黄酮含量;将500 nm处的吸光度值分别代入EC NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH的两条标准曲线方程,计算总黄酮含量。平行测定三次,计算平均值。

1.2.4.2 KAc法测雪菊EAE和n-BuOH-E总黄酮含量 分别准确移取0.30 mL EAE和n-BuOH-E待测液各两份于10 mL容量瓶中,分别加入70%的甲醇-水溶液稀释至溶液体积约为5 mL,再按照1.2.2.2中的操作步骤制备待测液并测吸光度。将415 nm处的吸光度值分别代入芦丁KAc-Al(NO3)3/AlCl3法两条标准曲线方程计算总黄酮含量;将435 nm处的吸光度值分别代入槲皮素KAc-Al(NO3)3/AlCl3法两条标准曲线方程计算总黄酮含量。平行测定三次,计算平均值。

1.2.5 络合显色法测定雪菊总黄酮含量的计算 将1.2.1.1中雪菊总黄酮提取液,用KAc-AlCl3反应体系进行络合,以芦丁为参照物,检测其总黄酮含量。

雪菊总黄酮提取液中总黄酮含量计算公式:

X=(C×V)/(m×1000)×100

式中,X(%):总黄酮的含量;C(mg/mL):由标准工作曲求得供试品溶液中总黄酮的浓度;V(mL):试样稀释体积倍数;m(g):试样质量。

1.2.6 HPLC法测定EAE和n-BuOH-E层中黄酮含量

1.2.6.1 色谱条件 菲罗门反相C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,3 μm);流动相:乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液,梯度:0～10 min,12%～25%乙腈;10～20 min,25%～40%乙腈;20～25 min,40%～70%乙腈;流速:1.0 mL/min;柱温:35 ℃;检测波长:280、385 nm;进样量:10 μL。

1.2.6.2 工作曲线的建立 分别精密称取10.0 mg黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷和奥卡宁标准品,用40%甲醇200 W超声溶解,定容至10 mL,配制成1 mg/mL标准储备液,4 ℃保存待用。

将标准品储备液稀释,配制黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷和奥卡宁标准品系列浓度(具体浓度范围见表3),经HPLC检测,以各化合物浓度(x)-峰面积(y)绘制标准工作曲线。

表3 四种主要雪菊黄酮标准曲线数据表Table 3 Linear regression data of four main flavonoids in Coreopsis tinctoria

1.2.6.3 EAE和n-BuOH-E层中四种雪菊黄酮含量检测 分别准确量取1.2.1.2中配制EAE和n-BuOH-E溶液各1 mL,过0.22 μm滤膜后进样,按照1.2.6.1中的色谱条件进行分析,将得到的峰面积代入工作曲线,平行测定三次,计算样品中四种雪菊黄酮的平均含量。

1.3 数据分析

采用Excel 2010软件统计分析数据,计算标准误差并绘制标准曲线。工作曲线绘制时所有实验数据均为重复三次的实验结果。

2 结果与分析

2.1 总黄酮测定显色反应体系考察

芦丁、槲皮素、表儿茶素和雪菊总黄酮样品溶液在NaNO2和KAc两种反应体系下分别在300～600 nm和250～600 nm波长下进行扫描。实验在NaNO2和KAc体系中分别探究了Al(NO3)3和AlCl3两种铝盐的影响,结果表明,采用不同的铝盐对结果几乎无影响,因此,实验只给出了一种结果。在NaNO2体系中,给出的是NaNO2-Al(NO3)3-NaOH络合显色反应体系图谱,在AlCl3体系中,给出的是KAc-AlCl3络合显色反应体系图谱,UV-Vis扫描结果如图1所示。表1为两种反应体系下的最大吸收波长及其数据比较。

图1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH(A)和KAc-AlCl3(B) 反应体系紫外-可见光谱图Fig.1 UV-visible spectrogram of NaNO2-Al(NO3)- NaOH(A)and KAc-AlCl3(B)reaction systems

由图1和表1可以看出,在NaNO2体系条件下,槲皮素对照溶液、雪菊总黄酮提取液的UV图谱明显不同,且槲皮素溶液与样品溶液的最大吸收波长相差近130 nm,因此,槲皮素不适合在该体系下作为标准品进行雪菊总黄酮含量的测定;在KAc反应体系下,EC对照溶液、雪菊总黄酮提取液的UV图谱明显不同,该反应体系条件下,EC在可见区几乎无吸收峰,EC的最大吸收波长与样品的最大吸收波长相差达到150 nm。因此,在该体系下,选择EC为对照品进行雪菊总黄酮含量的测定显然是不合适的。

表1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH和KAc-AlCl3体系最大吸收波长Table 1 The maximum absorption wavelength of NaNO2-Al(NO3)3-NaOH and KAc-AlCl3 systems

2.2 分光光度法测定雪菊黄酮标准曲线的绘制

表2为两种络合反应体系下,芦丁、EC和槲皮素的标准工作曲线数据。由表2可知,芦丁作为对照品,在两种体系下均呈现良好的线性关系(R2≥0.9997);EC和槲皮素分别在NaNO2体系和KAc体系下,线性关系良好(R2≥0.9996)。

表2 芦丁、EC和槲皮素对照品分别在NaNO2体系和KAc体系下工作曲线Table 2 Standard working curve of rutin,quercetin and EC under different reaction system

2.3 雪菊EAE和n-BuOH-E层中黄酮及雪菊总黄酮含量的测定

2.3.1 HPLC法测定EAE和n-BuOH-E层中黄酮含量

2.3.1.1 四种主要雪菊黄酮的HPLC检测波长的选择 黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、奥卡宁为雪菊中最主要的黄酮活性化合物,且含量也相对较高。黄诺玛苷和异奥卡宁属于二氢黄酮,采用二极管阵列检测器检测,测得其最大吸收波长为280 nm,马里苷与奥卡宁为查尔酮成分,其最大吸收波长为385 nm。因此,后续实验选择280、385 nm双波长检测。

2.3.1.2 HPLC检测四种雪菊黄酮工作曲线的建立 将黄诺马苷、异奥卡宁、马里苷、奥卡宁四种雪菊黄酮储备液分别稀释,以标准品浓度(x)-峰面积(y)绘制工作曲线,结果列于表3中。四种雪菊黄酮线性关系良好,R2≥0.9997。

2.3.1.3 四种主要雪菊黄酮的HPLC分离 分别取EAE和n-BuOH-E待测液,过0.22 μm滤膜后按照1.2.6.1给定的色谱条件进行分析,每个样品重复三次,结果如图2和图3所示。通过与标准品保留时间对比,确定峰1为黄诺马苷(6.7 min),峰2为异奥卡宁(10.1 min),峰3为马里苷(10.7 min),峰4为奥卡宁(15.1 min),四种黄酮均具有较好的峰形和且分离度良好,由图2和图3可知,EAE中异奥卡宁和奥卡宁的含量很高,n-BuOH-E中黄诺马苷和马里苷的含量很高。

图2 乙酸乙酯提取物的HPLC图Fig.2 Chromatogram of the ethyl acetate extract

图3 正丁醇提取物的HPLC图Fig.3 Chromatogram of the n-butanol extract

根据标准工作曲线回归方程计算待测溶液中黄诺玛苷、异奥卡宁、马里苷和奥卡宁四种黄酮的含量并计算其平均含量,结果见表4,EAE和n-BuOH-E中四种主要黄酮总含量分别为48.43%和43.19%。

表4 HPLC检测乙酸乙酯和正丁醇萃取物中四种CTFs的含量Table 4 The contents of four kinds of CTFs in EAE and n-BuOH-E determined by HPLC

2.3.2 紫外-可见分光光度法测EAE和n-BuOH-E中黄酮及雪菊总黄酮提取液中总黄酮含量 对雪菊EAE及n-BuOH-E分别在NaNO2和KAc两种体系下进行络合反应,在相应波长范围内进行连续波长扫描,再根据工作曲线计算其中总黄酮含量,所得结果列于表5。

表5 分光光度法检测雪菊乙酸乙酯、正丁醇萃取物中黄酮含量Table 5 The content of flavonoids in EAE and n-BuOH-E determined by spectrophotometric method

由表5可知,以芦丁为参照物,NaNO2反应体系会使雪菊总黄酮含量测定值偏离实际值非常大。这是由于凡具有邻二酚羟基的物质,均能用此法进行络合显色测定。雪菊中含有很多酚类、酸类,都具有邻二酚羟基结构[20],会对实验结果造成强烈的干扰。所以以芦丁为参照物,NaNO2体系不适合用于雪菊总黄酮含量的测定。

表6 芦丁为对照品的KAc-AlCl3法 测定雪菊总黄酮提取液中总黄酮含量Table 6 KAc-AlCl3 method determination of total flavonoids in chrysanthemum

对比表4和表5可知,HPLC法测得的雪菊EAE和n-BuOH-E中四种CTFs的总含量分别为48.43%和43.19%,而这两种萃取物中一定不止此4种黄酮,还存在含量低的黄酮类物质,因此采用络合显色法测得的总含量理论上应大于48.43%和43.19%。由表5可知,采用KAc-AlCl3法测得的总黄酮含量结果与HPLC法结果最为接近。KAC-AlCl3显色法对于含有邻二酚羟基的酚类和酚酸类等化合物显色前后在检测波长处无吸收,从而避免了此类物质对显色的干扰。槲皮素为芦丁的苷元,3位羟基可能对AlCl3显色反应有影响[29]。EC属于黄烷-3-醇类化合物,与雪菊主要黄酮结构存在一定差异。因此,确定雪菊乙酸乙酯及正丁醇萃取物中总黄酮含量最佳测定方法为以芦丁为参照物的KAc-AlCl3法。采用该方法对雪菊总黄酮提取液中总黄酮进行测定,连续测定5次,结果平均值为10.65%,RSD为5.5%。

3 结论

本文采用分光光度法分别以芦丁、槲皮素、表儿茶素为对照品,不同络合显色体系包括NaNO2-Al(NO3)3/AlCl3-NaOH和KAc-Al(NO3)3/AlCl3对雪菊乙酸乙酯及正丁醇萃取物中黄酮含量进行检测,通过HPLC法筛选出最佳体系为以芦丁为对照品的KAc-AlCl3法,并在最佳体系条件下测得雪菊总黄酮提取液中总黄酮的含量,本文为其它天然产物中黄酮含量准确测定提供了参考。同时,该测定方法灵敏度高、重复性好,且操作简单快速,成本较低,可为雪菊黄酮类成分深入研究及其在功能食品和药品方面的质量监控提供科学参考。