复合益生菌协同发酵葡萄汁菌种筛选与工艺优化

仵白敏,杨文博,刘 慧,张春岭,刘杰超,焦中高

(中国农业科学院郑州果树研究所,河南郑州 450009)

益生菌是指食用一定数量后对宿主健康有益的一类微生物[1],主要包括乳杆菌、双歧杆菌、乳球菌、链球菌、明串珠菌等[2-4],具有调节肠道菌群平衡、保护肠道屏障功能、提高免疫力、抗过敏等生理作用,对肠炎、应激性结肠综合征、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、癌症等多种疾病具有防治作用[3-7]。乳制品是益生菌应用最多、最为成熟的食品领域,但乳制品含有较高的脂肪和胆固醇,而且部分人群还存在乳糖不耐、乳蛋白过敏等健康风险,限制了益生菌发酵乳制品的消费[8]。因此,寻找其它非乳原料作为益生菌载体成为研究热点。

水果富含糖、酸、黄酮、胡萝卜素、膳食纤维、维生素、矿物质等多种营养成分和生物活性物质,是益生菌发酵的理想基质[2]。李维妮等[9]利用副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌协同发酵苹果汁,在最佳工艺条件下得到的活菌数可达1.985×108CFU/mL。罗心欣等[10]利用植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌混合发酵猕猴桃汁,最优工艺条件下活菌数为2.185×108CFU/mL。一些果汁经益生菌发酵后多酚、γ-氨基丁酸等生物活性物质的含量和抗氧化活性得到提高[11-15],说明适宜的益生菌发酵可作为改善果汁功能特性的重要手段。

当前用于果汁发酵的乳酸菌以牛奶发酵菌株较多,但由于果汁具有较高的酸度,牛奶发酵菌株难以适应果汁的高酸环境,造成其在果汁中发酵能力有限,不能有效发酵果汁产生良好的风味和营养物质[16],因此筛选适用于不同种类果汁发酵的专用菌株并完善发酵工艺成为益生菌发酵果汁产业化的关键。本研究以巨玫瑰葡萄为原料,经过初筛和复筛,得到适宜葡萄汁发酵的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)21802和短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)6239,并将两株菌进行复配,以活菌数和感官评分为指标,对复合益生菌协同发酵葡萄汁工艺进行优化,以期为益生菌发酵葡萄汁的产业化开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

巨玫瑰葡萄 采于中国农业科学院郑州果树研究所新乡基地;布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)6067、柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)23234、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)6001、肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)22241、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)24450、肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)22184、唾液乳杆菌水杨素亚种(Lactobacillussalivariussubsp.salicinius)21808、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)6239、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)21798、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)21822、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)21830、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)22703、类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)22709、棒状乳杆菌棒状亚种(Lactobacilluscoryniformissubsp.coryniformis)22701、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)21800、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)21865、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)21832、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)6222、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)21802、消化乳杆菌(Lactobacillusalimentarius)21852和发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)21838 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心;MRS培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司;Folin-酚试剂 美国Sigma公司;没食子酸 上海源叶生物科技有限公司;其它试剂均为国产分析纯。

JYL-G12E榨汁搅拌机 中国九阳股份有限公司;D-500大龙均质匀浆机 赛伯乐(上海)仪器有限公司;PHS-3C型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;WFJ 7200型可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;DHP型电热恒温培养箱 上海浦东荣丰科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄汁的制备

1.2.1.1 工艺流程 葡萄→挑选→清洗→打浆→灭酶→冷却→均质→杀菌→葡萄汁

1.2.1.2 关键操作要点 打浆与灭酶:将清洗干净的葡萄于榨汁搅拌机中匀浆至果粒充分破碎,立即置于沸水中水浴5 min灭酶。

均质:使用均质匀浆机将灭酶冷却后的葡萄汁于25 ℃均质(500 W,20 min)。

杀菌:将均质后的葡萄汁分装于250 mL的锥形瓶中,装液量100 mL,用透气封口膜封口,置于压力蒸汽灭菌器灭菌(95 ℃,10 min),然后冷却至室温备用。

1.2.2 菌种活化与种子液制备 将益生菌菌粉接种于灭菌后的MRS培养基中活化,按照菌种说明书上的最适生长温度培养48 h后传代2次(活化后的菌液浓度达1010CFU/mL),再将活化后的菌种接种于灭菌的葡萄汁中培养48 h,使益生菌菌种适应葡萄汁中的环境。培养后的种子液浓度达到109CFU/mL。

1.2.3 菌种筛选 菌种筛选分初筛和复筛。初筛主要考虑各菌株在葡萄汁中的发酵产酸能力和对酚类物质的影响。将21株益生菌种子液分别接种于葡萄汁(接种量5%)中,在各自最适生长温度下发酵72 h,以发酵液的总酚含量和pH为考察指标,从21株益生菌中筛选出总酚含量较未接种益生菌的葡萄汁对照组升高最多、pH较对照组降低最多的益生菌各3株,分别是消化乳杆菌21852、植物乳杆菌21802、短乳杆菌6239、戊糖乳杆菌21798、戊糖乳杆菌21832和发酵乳杆菌21838,其最适生长温度均为37 ℃。复筛主要考虑菌株在葡萄汁中的发酵能力、耐受性和对感官品质的影响。将初筛得到6株菌分别接种于葡萄汁(接种量5%)中,在37 ℃条件下发酵,每间隔一定时间取样分析活菌数,结合感官评定筛选出最终发酵液中活菌数最多、感官评分最高的益生菌各1株,进行进一步的复配和工艺优化试验。

1.2.4 菌种复配试验 将复筛得到的两株益生菌种子液分别按照3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶0、0∶1的比例,接种于葡萄汁(接种量5%)中,置于37 ℃下发酵72 h,测定发酵液活菌数并进行感官评定。筛选出最佳菌种比例后进行复合益生菌协同发酵工艺优化试验。

1.2.5 复合益生菌协同发酵葡萄汁单因素实验

1.2.5.1 葡萄汁稀释倍数 设定葡萄汁与水的体积比为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、1∶0,接种量5%,37 ℃下发酵60 h,分别测定其活菌数并进行感官评分。

1.2.5.2 接种量 葡萄汁与水的体积比为2∶1,设定接种量分别为1%、3%、5%、7%、9%,37 ℃下发酵60 h,分别测定其活菌数并进行感官评分。

1.2.5.3 发酵温度 葡萄汁与水的体积比为2∶1,接种量5%,分别置于30、34、37、40 ℃条件下发酵60 h,测定其活菌数并进行感官评分。

1.2.5.4 发酵时间 葡萄汁与水的体积比为2∶1,接种量5%,发酵温度37 ℃,发酵时间分别为12、24、36、48、60、72、84 h,测定其活菌数并进行感官评分。

1.2.6 益生菌发酵葡萄汁工艺正交试验 在单因素实验基础上,选取发酵温度、发酵时间、接种量为自变量,以活菌数和感官评分为评价指标进行3因素3水平正交试验,因素水平设计见表1。

表1 最佳发酵工艺正交实验设计Table 1 Orthogonal test design of the optimal fermentation conditions

1.2.7 分析方法 总酚含量采用Folin-酚法[17]测定,以没食子酸计。pH的测定采用pH计法。益生菌活菌数的测定按照GB 4789.35-2016规定方法进行。

1.2.8 感官评定 参考任婷婷等[18]、郗恩光等[19]的方法,由10名具有专业背景的老师和同学组成品评小组,从色泽、口感、香气、组织状态四个方面进行感官评定。评分标准见表2。

表2 不同益生菌发酵葡萄汁感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of grape juice fermented with different probiotic strains

1.3 数据处理

所有试验均做三次重复,试验结果用SAS 9.2进行方差分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选

初筛得到的6株益生菌在葡萄汁中的生长曲线如图1所示。

图1 不同益生菌在葡萄汁中的生长及发酵曲线Fig.1 Growth curves of different probiotic strains in grape juice

由图1可见,初筛所选的6株益生菌在葡萄汁中发酵72 h后其活菌数均可达到108CFU/mL以上,符合益生菌发酵产品的活菌数标准要求。其中,植物乳杆菌21802发酵葡萄汁中活菌数最高,发酵72 h时为2.00×109CFU/mL,其他均在109CFU/mL以下。

为了解不同菌株发酵对葡萄汁感官品质的影响,进一步对发酵后的葡萄汁进行感官评定,结果见图2。

图2 不同益生菌发酵的葡萄汁的感官评分Fig.2 Scores of sensory evaluation of grape juices fermented with different probiotic strains注:不同大写字母表示差异显著(P<0.05),图3～图7。

由图2可以看出,短乳杆菌6239和消化乳杆菌21852发酵后的葡萄汁的感官评分显著高于其它几种菌发酵后的葡萄汁,且优于未发酵的葡萄汁(P<0.05),而戊糖乳杆菌21832和戊糖乳杆菌21838发酵的葡萄汁感官评分显著低于未发酵葡萄汁(P<0.05)。综合考虑活菌数和感官评分,选择植物乳杆菌21802(活菌数最高)和短乳杆菌6239(感官评分最高)作为复配菌种,进行协同发酵试验。

2.2 菌种复配试验

为获得两株益生菌的适宜复配比例,以活菌数和感官评分为指标,对不同比例植物乳杆菌21802和短乳杆菌6239在葡萄汁中的发酵情况进行了考察,结果见图3。

图3 不同菌种比例发酵葡萄汁的活菌数与感官评分Fig.3 Viable count and sensory evaluation of grape juices fermented with different ratio of Lactobacillus plantarum 21082 and Lactobacillus breris 6239

由图3可以看出,随着短乳杆菌6239比例的增加,葡萄汁的感官评分逐渐增加,而增大植物乳杆菌21802的比例则有助于活菌数的增加。这也与初筛时两株菌在葡萄汁中的表现相一致。当植物乳杆菌21802与短乳杆菌6239的比例为1∶2时,葡萄汁的感官评分最高,其活菌数也达到最高,继续增大植物乳杆菌21802与短乳杆菌6239的比例则造成感官评分的大幅降低。因此确定植物乳杆菌21802与短乳杆菌6239的适宜复配比例为1∶2。

2.3 复合益生菌协同发酵葡萄汁单因素实验

2.3.1 葡萄汁稀释倍数对复合益生菌协同发酵葡萄汁的影响 全葡萄汁含酸量较高,会影响益生菌的生长,而且成本也较高。但稀释倍数过高会造成风味变淡,影响发酵葡萄汁的感官品质。不同稀释倍数对复合益生菌发酵葡萄汁的活菌数及感官评分的影响见图4。

图4 不同稀释倍数对复合益生菌协同 发酵葡萄汁活菌数和感官评分的影响Fig.4 Viable count and sensory evaluation of fermented grape juices with different dilution ratio

由图4可以看出,当葡萄汁与水的比例由1∶3增至2∶1时,益生菌发酵葡萄汁的感官评分和活菌数逐渐增加,进一步增大葡萄汁的浓度则对活菌数和感官评分没有显著影响(P>0.05),说明葡萄汁与水的比例为2∶1时其营养成分既可满足益生菌的生长及发酵需求,同时还可保证益生菌发酵葡萄汁的风味。因此选择葡萄汁与水的比例2∶1作为葡萄汁的适宜稀释倍数。

2.3.2 接种量对复合益生菌协同发酵葡萄汁的影响 不同接种量对复合益生菌协同发酵葡萄汁的影响见图5。当接种量低于5%时,随着接种量的增加,发酵葡萄汁中活菌数及感官评分均逐渐增高,但当接种量超过5%后,进一步增大接种量则对活菌数没有显著影响(P>0.05),但感官评分略有降低。因此,接种量以5%左右比较适宜。

图5 不同接种量对益生菌发酵葡萄汁 活菌数和感官评分的影响Fig.5 Viable count and sensory evaluation of grape juices fermented with different inoculation ratio

2.3.3 发酵温度对复合益生菌协同发酵葡萄汁的影响 随着发酵温度的升高,益生菌发酵葡萄汁的活菌数和感官评分均呈先升高后降低的趋势。由图6可见,发酵温度为34 ℃时活菌数和感官评分均为最高,30和40 ℃发酵时活菌数最低,这可能是因为温度过低,益生菌生长发酵缓慢,而温度过高则会造成菌种老化死亡,产生异味,从而造成感官评分降低。与34 ℃相比,37 ℃发酵葡萄汁的活菌数略有降低,但感官评分没有显著差异(P>0.05)。因此,发酵温度以34 ℃左右为宜。

图6 发酵温度对益生菌发酵葡萄汁 活菌数和感官评分的影响Fig.6 Viable count and sensory evaluation of grape juices fermented at different temperature

2.3.4 发酵时间对复合益生菌协同发酵葡萄汁的影响 图7所示为不同发酵时间葡萄汁的活菌数及感官评分。由图7可见,随着发酵时间的延长,发酵葡萄汁中活菌数和感官评分均逐渐增加,至60 h后均达到稳定,进一步延长发酵时间则对活菌数和感官评分均没有显著影响(P>0.05)。因此,发酵时间以60 h左右为宜。

图7 发酵时间对复合益生菌发酵葡萄汁 活菌数和感官评分的影响Fig.7 Viable count and sensory evaluation of grape juice fermented for different time

2.4 复合益生菌协同发酵葡萄汁工艺正交试验结果

为获得复合益生菌发酵葡萄汁的最佳工艺条件,在单因素实验基础上,固定葡萄汁与水的比例为2∶1,选择接种量、发酵温度、发酵时间3个因素,以活菌数和感官评分为评价指标,进行3因素3水平正交试验,结果见表3。

表3 复合益生菌协同发酵葡萄汁正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of grape juice fermented with compound probiotics

由表3可见,影响复合益生菌发酵葡萄汁活菌数的最主要因素是发酵温度,其次是接种量,发酵时间的影响极小;对感官评分的影响也以发酵温度为最大,其次是发酵时间,接种量的影响最小。方差分析结果(表4)也表明,发酵温度对葡萄汁的活菌数和感官评分有显著影响(P<0.05),而发酵温度和接种量的影响不显著(P>0.05)。以活菌数为考察指标,复合益生菌协同发酵葡萄汁的最优化工艺条件为A3B1C2,而以感官评分为考察指标得到的最佳工艺条件为A3B2C2。考虑到发酵时间(B)对活菌数的影响极小(极差为0.04),而方差分析结果亦不显著(P>0.05),而发酵时间(B)对感官评分的影响相对较大(极差为2.77),综合判定选择A3B2C2作为复合益生菌发酵葡萄汁的最佳工艺,即发酵温度为36 ℃、接种量5%,发酵时间60 h,在此条件下发酵所得益生菌发酵葡萄汁的活菌数为8.98×109CFU/mL,感官评分为91.1分。这一结果优于文献中报道的益生菌发酵苹果汁[9]、猕猴桃汁[10]、石榴汁[11]以及枸杞汁[20]在最优工艺条件下所达到的活菌数,说明本研究所筛选益生菌在葡萄汁中具有良好的发酵特性,适合于益生菌发酵葡萄汁的生产。

表4 方差分析表Table 4 Results of variance analysis

3 结论

本研究通过菌种初筛和复筛,获得适宜葡萄汁发酵的植物乳杆菌21802和短乳杆菌6239,并将两株菌进行复配进行协同发酵,其最优化工艺条件为:每2体积的葡萄汁加入1体积的水,植物乳杆菌21802与短乳杆菌6239菌种比例为1∶2,接种量5%,发酵温度36 ℃,发酵时间60 h。此条件下发酵所得益生菌发酵葡萄汁活菌数可达到8.98×109CFU/mL,感官评分为91.1分。