响应面法优化毛虾酶解工艺条件

侯小桢，张伊敏，林群超，章 斌

（韩山师范学院 食品工程与生物科技学院，广东 潮州 521041）

水解蛋白由于富含氨基酸、氨基酸钠盐与多肽，已被广泛地应用于食品工业作为营养补充剂、功能性配料、鲜味料或通过与还原糖发生Maillard反应制备热加工味料［1-2］.蛋白质水解方法主要有酸水解法、碱水解法及酶解法，酸水解法易产生氯丙醇，生成的香料仿真度低，且水解产物中色氨酸基本都会被破坏，目前该法基本被淘汰；碱水解法容易使氨基酸消旋，甚至会生成有毒害的手性对映体，一般食品加工中不能采用.蛋白质酶解法是利用酶的催化分解作用，将大分子的肉类蛋白质在一定程度上切割成小分子的肽类和氨基酸.用酶解技术获得的水解动物蛋白含有大量的游离氨基酸，可以用于调味品的增香，增加风味料的浓度，使制得的产品风味明显，滋味完美，可广泛用于各种食品、保健食品及用作各类天然香精的基料，该法是目前较为理想的制备方法，也是今后咸味调味料生产的主流趋势［3-5］.目前已有不少采用蛋白酶水解的牛肉、鸡肉、猪肉的报道，制得的动物水解蛋白可用于制备肉类香料.

粤东地区的海洋低值虾类资源极为丰富，但利用却相对滞后；每年都有大量的低值虾类因各种原因被废弃或加工成附加值很低的产品，或成为饲料等，而更多的低值虾由于未被及时利用而排入海洋，造成资源的浪费和海洋环境的污染.研究表明［6-7］，毛虾这一低值虾中含多种矿物质元素，蛋白质含量丰富，其中含有人体必需的8种氨基酸，是非常优良的食物蛋白资源.而目前对这一优质资源的研究应用相对较少.因此，本文以盛产于粤东地区的低值毛虾为试材，在筛选最佳蛋白酶种类基础上，探讨毛虾的蛋白酶解影响因素，并通过响应面法优化其酶解工艺条件，以期获得风味良好的虾味香料的反应前体物质，为毛虾的高值化综合利用提供一定试验参考.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

毛虾：购于饶平海鲜综合市场，-18 ℃冰柜储存；Flavourzyme风味蛋白酶（500 LAPU/g）、Papain木瓜蛋白酶（5×105U/g）、Alcalase 碱性蛋白酶（2.4 AU/g）、Neutrase 中性蛋白酶（1.5 AU/g）、Protamex复合蛋白酶（1.5 AU/g）：诺维信生物技术有限公司.浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、蒽酮、三氯乙酸等：均为分析纯.

DDY-1C 型自动定氮仪：北京兴华真空仪表厂；UV755B 紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；AUW120型电子分析天平：日本岛津公司；HJ-6磁力搅拌器：常州国华电器有限公司；HHS11-4电热恒温水浴锅：上海悦丰仪器仪表有限公司；L-8800氨基酸分析仪：日本日立公司.

1.2 方法

1.2.1 酶解工艺流程

毛虾→晒干→去杂质→粉碎→加水→预热→酶解→升温灭酶→离心→酶解液.

1.2.2 酶解单因素试验

按一定固液比（1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8 g/mL）配制毛虾和水的混合物，加入不同量（500 U/g、600 U/g、700 U/g、800 U/g）的蛋白酶后，在不同pH（水的自然pH 6.8、pH 5.5、pH 7.0、pH 8.5）、不同酶解温度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）条件下，酶解不同时间（0、1、2、3、4、5、6 、7 h）；以酶解产物中的AAN含量和TCA可溶性氮含量为主要评价指标，优选酶解条件.

1.3 试验指标与测定方法

可溶性氮（TCA）含量的测定：参照迟海［8］所述方法进行.水分含量的测定［9］：常压干燥法；总氮含量测定［9］：微量凯氏定氮法；脂肪含量测定［9］：索氏提取法；还原糖测定：按《GB 5009.7-2016食品安全国家标准：食品中还原糖的测定》进行；灰分测定［9］：高温灼烧法；氨基酸态氮（AAN）含量测定［9］：甲醛电位滴定法；总糖测定［9］：蒽酮比色法；游离氨基酸测定：按《GB 5009.124-2016食品安全国家标准：食品中氨基酸的测定》进行；总氨基酸测定［9］：甲醛滴定法.

2 结果与分析

2.1 毛虾成分分析

试验所用原料毛虾的主要成分、游离氨基酸和总氨基酸含量如表1、表2所示.由表1可看出，毛虾蛋白质含量丰富，高达66.48%；表2测定结果表明毛虾蛋白质中各类氨基酸的组成合理，富含人体健康所需的8种必须氨基酸，其中5种必须氨基酸含量超过2 000 mg/100 g，因此具有很好的开发前景.

2.2 蛋白酶筛选

表1 毛虾主要成分的含量

依据所购酶的最适活力条件及前期预试验，在各酶的最适条件下；固液比为1∶5 g/mL，加酶量为E/S = 600 U/g，50 ℃下水解5 h，酶解效果如图1、图2 所示，可见Protamex 和Flavourzyme 的AAN和TCA可溶性氮含量都比较高，酶解效果较好，Papain次之，而Alcalase和Neutrase较弱；但结合表3的酶解液感官评定结果，可看出Protamex酶解效果虽然较好，但虾香味较弱，且鲜味也不够突出；Papain的酶解效果虽不及Protamex，但其酶解液口味较好，回味甘甜；Flavourzyme作用后的酶解液虾香浓郁，后味较好；Alcalase和Neutrase无论从酶解效果和感官评定上都相对较差，且两种酶的价格也相对昂贵.综合酶解效果和酶本身的购买成本考虑，选用Flavourzyme风味蛋白酶为试验用酶.

表2 毛虾的游离氨基酸和总氨基酸含量

图1 各种蛋白酶对AAN含量的影响

图2 各种蛋白酶对TCA可溶性氮含量的影响

2.3 风味蛋白酶酶解毛虾的单因素试验

2.3.1 酶用量对酶解效果的影响

一定条件下，酶解反应速度与酶浓度成正比；但当酶浓度达到一定值，所有酶分子已被底物所饱和，即酶分子与底物结合部位己被占据，速度则不再增加［3-4］.从图3和图4可看出：AAN值和TCA可溶性氮值均随酶用量增加而增加，但增加幅度不明显，可能是因为在试验条件下，底物的量是一定的，酶用量较大时，E/S 值越大，在水解的起始阶段水解速度较快，底物迅速减少，且随时间的延长，底物减少到一定量引起水解速度的增加减缓或不再增加.酶解5 h时，添加量为700 U/g的毛虾液中的AAN 值仅比600 U/g 的增加0.0157 g/100 mL，TCA 可溶性氮含量也仅多了0.013 g/mL.因此，从经济角度考虑，确定风味蛋白酶用量为600 U/g.

2.3.2 固液比对酶解效果的影响

酶解反应过程中，提高底物浓度一定程度上可加快反应速度［5］.图5和图6表明：随酶解时间的延长，AAN含量和TCA可溶性氮含量随固液比增大呈先增大后降低的变化趋势；且在固液比1∶4时达至最高.造成这一现象的可能原因是固液比过高，底物浓度和酶的有效浓度均降低，不利于底物在溶解状态下与酶有效结合，酶解效果较差；固液比过低时，除酶解效果不理想外，还将导致后期浓缩工序的时间延长；因此，综合考虑确定本试验的最佳固液比为1∶4.

表3 蛋白酶作用后的酶解液感官评定

图3 酶用量对AAN含量的影响

图4 酶用量对TCA可溶性氮含量的影响

图5 固液比对AAN含量的影响

图6 固液比对TCA可溶性氮含量的影响

2.3.3 酶解温度对酶解效果的影响

温度主要从两个方面直接影响蛋白质酶解反应的效率：一是对蛋白酶催化反应速度的影响，即温度过低，蛋白酶活性不足，酶解反应速度相应较低；温度过高，则易使蛋白酶失去活性，同样降低酶解反应速率.二是对蛋白酶稳定性的影响，即温度升高使酶分子更活跃，蛋白质与酶分子的碰撞更频繁，从而提高蛋白酶的酶解速度.从图7 和图8 可看出：随着温度的升高，毛虾液中的AAN 含量和TCA可溶性氮含量先升高后降低，于50 ℃时达到最高，因此，确定酶解温度在50～55 ℃范围较适宜.

图7 酶解温度对AAN含量的影响

图8 酶解温度对TCA可溶性氮含量的影响

2.3.4 pH值对酶解效果的影响

pH值对酶催化反应的影响包括两个方面：影响酶的稳定性和影响酶与底物的结合以及酶催化底物转变成产物.酶只有处于游离状态时，才能与底物结合，不同的pH 值会使酶处于不同的游离状态，产生不同的空间构象从而影响酶的活力和酶解效果.由图9和图10可知，pH 7.0的酶解液中AAN含量和TCA可溶性氮含量最低，pH 5.5、pH 8.5次之；但采用添加缓冲盐的酶解液，其风味均较差；而采用自来水的自然pH 6.8 为pH 的酶解液，其AAN 含量和TCA 可溶性氮含量最高，整体风味也最好，这可能是因为在自来水的自然pH 6.8下，酶分子上的必需基团处于最佳的解离状态，最适合与底物结合并催化底物反应，从而使得反应速度加快，酶解效果更好.因此，确定采用自来水的自然pH 6.8为最佳pH值.

图9 pH值对AAN含量的影响

图10 pH值对TCA可溶性氮含量的影响

2.3.5 酶解时间对酶解效果的影响

从图11和图12可看出，毛虾液中的AAN含量和TCA可溶性氮含量随时间的延长而逐渐增加，酶解6 h后的增加速率变缓，可能是由于随酶解时间的延长，底物逐渐减少，产物逐渐增加，导致反应速度逐渐下降；且试验中观察到酶解时间超过8 h后的酶解液，颜色加深并产生异味，对后期进行美拉德反应带来不利的影响；同时，延长酶解时间会增加生产成本和微生物繁殖的机会.因此，试验选择最佳酶解时间为6 h.

图11 酶解时间对AAN含量的影响

图12 酶解时间对TCA可溶性氮含量的影响

2.4 酶解工艺的优化试验

2.4.1 Box-behnken响应面设计与结果

在上述单因素试验结果基础上，考虑到后续美拉德反应的进行，以AAN 含量为指标，采用Box-Behnken响应面法优化酶解工艺条件，试验设计及结果见表4.

2.4.2 回归方程模型的建立

运用SAS RSREG程序对15个试验点的响应值进行回归分析，确定试验回归方程如下：

Y = 0.924333 + 0.0085X1+ 0.0615X2+ 0.01125X3- 0.048792X12+ 0.00175X1X2+ 0.00175X1X3-0.022792X22-0.00725X2X3-0.028292X32

对该模型方程及回归系数进行方差分析，结果见表5.

由表5 可看出，方程的F 值=38.77369 ＞f0.01（9，5）=10.2，说明该方程是高度显著的，从回归方程各项方差的进一步检验也可看出，失拟检验不显著，说明模型是很理想的.X2（时间）、X3（加酶量）对Y（AAN含量）具有线性影响，X1（温度）、X2和X3具有二次影响，而交互项的影响不显著，说明试验因子与响应值间不是简单的线性关系.根据F值的大小，可判定各试验因子对响应值Y的影响依次是：X2（时间）＞X12（温度的二次项）＞X32（加酶量的二次项）＞X22（时间的二次项）＞X3（加酶量）.

2.4.3 响应面分析

由图13 可看出随着温度的升高，AAN含量先增加再降低；随着时间的延长，AAN含量呈上升趋势；随着加酶量的增加，AAN含量先明显增加，之后增长缓慢.由图14可知，当加酶量一定的时候（X3=0），随着酶解时间的延长，AAN含量逐渐增大，而酶解时间没有优化值；随着温度的变化，AAN 含量也随之增加，达到一个最高点后，又逐渐减小；在温度0～0.3（55～56.6 ℃），时间在设定时间内，响应面有最大值.由图15可知，当时间一定的时候（X2～0），随着温度的升高和加酶量的增加，AAN含量都是先增加后逐渐减小；在温度0～0.3（55～56.6 ℃），加酶量0～0.3（600～630 U/g）之间，响应面有极大点.由图16 可知，当温度一定的时候（X1=0），随着加酶量的增加，AAN含量先增加后逐渐减少；随着时间的延长，AAN含量显著增加，达到最大的时候已经超过试验设计的时间；在加酶量0～0.3（600～630 U/g）之间，在时间在设定时间内，响应面有最大值.

表5 回归方程的方差分析

图13 温度（X1）、时间（X2）、加酶量（X3）对Y响应的模型曲线图

2.4.4 优化结果

考虑到酶解时间、酶解液风味与后期美拉德反应液的风味关系，在最大限度提高游离氨基酸含量的基础上，对Y进行优化；得到的最佳组合为：固液比1∶4，pH为自来水的自然pH 6.8，酶解温度55 ℃，酶解时间6 h，加酶量600 U/g，此条件下的理论值Y=0.963；得此优化条件下的试验验证值为Y=0.958，且得到的酶解液风味较好，虾香浓郁，进一步证明响应面法得到的最佳工艺条件的可靠性.

图14 温度（X1）和时间（X2）对AAN含量的影响

图15 温度（X1）和加酶量（X3）对AAN含量的影响

图16 时间（X2）和加酶量（X3）对AAN含量的影响

3 结论

对毛虾的营养成分进行分析，包括水分、粗蛋白、脂肪、灰分、总糖等成分，其中粗蛋白达到66.48%，是良好的蛋白质资源；游离氨基酸为72.10 g/L，总氨基酸达到54 360 mg/100 g，其中人体必需氨基酸含量丰富，蕴含巨大的开发价值.

经不同蛋白酶的初步筛选，确定试验用酶为风味蛋白酶.单因素试验确定风味蛋白酶的酶解条件为：固液比1∶4，加酶量600 U/g，以自来水的自然pH为6.8，在50～55 ℃下酶解5～6 h，AAN含量达到0.88 g/100 mL.

通过Box-Behnken中心组合设计试验，建立酶用量、酶解时间、酶解温度三因素相互关系的模型：Y=0.924333 + 0.0085X1+ 0.0615X2+ 0.01125X3- 0.048792X12+ 0.00175X1X2+ 0.00175X1X3- 0.022792 X22-0.00725X2X3-0.028292X32.同时，响应面优化试验确定酶解最佳条件为：固液比1∶4，pH为自来水的自然pH6.8，酶解温度55 ℃，酶解时间6 h，加酶量600 U/g，此条件下的AAN 含量理论值Y=0.963 g/100 mL.

通过酶解所得的毛虾酶解产物可作为香料的前体物质或基香使用，也可将酶解产物直接作为原料或配料加工成调味酱等休闲食品，但具体工艺参数条件仍需依据其实际用途或目标产品要求进一步探讨.