在儿童急性淋巴细胞白血病中大剂量甲氨蝶呤药物毒性与基因多态性的相关性研究进展

孟 岑，卢雨昕，徐 刚，郝良纯

0 引言

急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤，占儿童所有恶性肿瘤的30%。在过去20年中，随着儿童ALL特异性化疗的进展，所有患者的生存率都有了显著提高，约90%的儿童生存超过5年。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是一种抗叶酸化疗药物，能显著降低白血病的复发率。然而，MTX治疗往往会因为引起毒性而减少剂量或停止治疗。目前，可通过检测MTX血药浓度，调整亚叶酸钙的解救剂量和次数，直到MTX浓度在安全范围内。在实际治疗中，相同MTX剂量的不同患者中，出现的药物毒副反应及MTX血药浓度是因人而异的。研究表明，MTX代谢酶的相关基因可通过影响MTX的代谢过程，进而影响其不良反应及血浆浓度。因此，治疗前检测MTX代谢相关酶的基因型，准确预测MTX治疗的不良反应程度，对ALL患者是非常有益的[1]。

1 MTX代谢过程及相关酶的作用

MTX是二氢叶酸还原酶(DHFR)的竞争性抑制剂。其结构与生理性叶酸相似，可以通过还原叶酸载体(RFC1)介导[也称为溶质载体家族19成员1 (SLC19A1)转运蛋白]，主动转运进入细胞，进入细胞后可直接以原形与二氢叶酸还原酶(DHFR)及其他靶酶结合，从而抑制DHFR的功能。在细胞内，MTX 在多聚谷氨酰胺合成酶(Polyglutamyl synthetase，FPGs)的作用下被转换成活性形式的多聚谷氨酸形式(MTX-PGs)，保留在肝脏及骨髓前身物质及成纤维细胞中，这个过程能被γ-谷氨酰基水解酶(GGH)逆转，后者能催化γ-多聚谷氨酸的去除，从而推进MTX流出细胞。MTX-PG与DHFR的结合力更强，且解离速度更慢，竞争性抑制DHFR的能力更强，从而抑制DNA和RNA的合成。此外，其能抑制将dUMP转化为dTMP的胸苷酸合成酶(TYMS)，从而提供另一种抑制DNA和RNA合成的途径，故MTX可以通过原形及MTX-PG的形式抑制嘌呤的合成过程，造成细胞死亡，从而产生抗肿瘤作用。MTX是通过不同的转运体向细胞外转运的途径从生物体中排出，使MTX代谢，从而降低MTX的有效水平。MTX通过转运体家族(ATP-binding cassete，ABC)流出细胞，其中ABCC1-4及ABCG2在MTX流出细胞时发挥了主要作用。

2 MTX的不良反应

MTX已广泛应用于大多数恶性血液病的化疗方案中。MTX，尤其是高剂量MTX (HD-MTX)作为目前儿童ALL治疗方案的主要组成部分，与临床治疗成功显著相关。同时，HD-MTX可能引起毒性，导致应用剂量减少或治疗中断，危及生存。

MTX的不良反应体现在各个系统中，报道较多的MTX(包括大剂量MTX和MTX缓解维持治疗)不良反应是溃疡性口炎、恶心、发热和白细胞减少。MTX的其他不良反应按各器官系统表现如下：消化系统，牙龈炎、咽炎、口腔炎、厌食症、恶心、呕吐、腹泻、胃肠溃疡和出血、肠炎、胰腺炎、肝功能异常等；骨髓抑制，血小板减少、贫血、白细胞减少、中性粒细胞减少等；泌尿系统，肾功能异常、蛋白尿等；心血管系统，心包炎、心包积液、低血压、血栓栓塞事件等；中枢神经系统，头痛、嗜睡、视力模糊等。

由于化疗药物引起的毒副作用导致化疗暂停或终止，可使ALL复发或死亡增加。同时，临床研究显示，不同个体使用相同剂量MTX出现的临床疗效及毒副反应各不相同，治疗过程中药物对人体的疗效和毒副反应的严重程度很难预测，会导致排泄延迟的患儿出现严重的毒副反应。有研究表明，MTX在药代动力学、有效性和毒性方面存在个体差异，提示可能有一些潜在的基因靶点影响MTX的药代动力学和药效学[2]。MTX在细胞内代谢过程复杂，有一系列代谢关键酶及转运蛋白，其基因多态性极可能是造成毒副作用差异的重要原因。

3 MTX代谢酶的药物遗传学

药物遗传学是研究药物代谢途径中遗传基因差异的学科，主要研究药物代谢酶、靶点、转运体的遗传变异及其相互作用如何产生特定的药物相关表型。常见的遗传变异有单核苷酸多态性(SNPs)、拷贝数变异、基因组的小插入和缺失。MTX治疗的临床结果是由许多影响MTX药代动力学和药效学的基因产物的相互作用所决定。此外，遗传信息通常用于个性化药物选择和剂量。多项研究均表明，编码膜内或膜外转运蛋白的基因中的SNPs与MTX的药代动力学、毒性和临床疗效的个体间差异有关。

目前，用于评估MTX治疗的有效性及不良反应的常见基因：MTHFR、TYMS、ATIC、AMPD-1、ITPA、MTR、MTRR等。

3.1MTHFR基因 亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是参与叶酸循环的重要酶。MTHFR催化5,10-甲基戊二氢叶酸(5,10-CH2-THF)不可逆地转化为5-甲基四氢叶酸(5-CH-THF)，前者是嘌呤和胸腺嘧啶的合成所需，后者为同型半胱氨酸在MTX的作用下甲基化生成蛋氨酸的甲基供体，这是蛋白质合成和核酸甲基化所必需的[3-5]。由于MTHFR活性的改变，叶酸的减少可能使恶性和非恶性细胞对MTX的反应产生显著影响。因此，5,10-CH2-THF转化为5-CH2-THF，随后在胞内叶酸池中进行修饰，可能会增加MTX的毒性效应。Den等[6]研究了35例新诊断为ALL的患者，结果MTHFR677C>T多态性与血浆MTX水平无显著相关性。近年来，研究主要集中在2种单核磷酸多态性上：677C>T (rs1801133)和1298A>C (rs1801131)。Yao等[7]纳入了17项研究(2007-2016年发表的队列研究，共纳入2 133例患者)进行了Meta分析，研究没有观察到MTHFRC677T基因多态性与MTX治疗后不良反应的发生有任何相关性。Wang等[8]的研究中指出，与MTHFR-677CC和MTHFR-677CT相比，MTHFR-677TT基因携带者MTX相关的不良反应报告更多。Yang等[9]阐述了MTHFR677T突变与肝脏毒性显著相关，而A1298C仅与皮肤毒性(黏膜炎)相关。Lopez-Lopez等[10]研究结果显示，C677T和A1298C突变与儿童使用HD-MTX的毒副作用相关性较低。Umerez等[11]总结了13篇选定的文献，分析了677C>T多态性与MTX毒性之间的关系。其中，只有5项研究发现其与毒性显著相关，但结果相反，3项研究认为，T变异等位基因与毒性风险的增加相关[12-14]，而另外2项研究认为，其与风险的降低相关[15-16]。在选择的13篇文献中，10篇讨论了1298A>C多态性与MTX诱导毒性的关系。其中，只有3项研究发现两者之间存在相关性，但效果存在矛盾。考虑到相反的结果，几乎没有研究发现这种多态性与MTX诱导的毒性之间有显著的关联。而Zhu等[17]的Meta分析研究表明，MTHFR677T多态性与MTX毒性(特别是黏膜炎)有关，未发现MTHFRA1298C多态性在预测MTX毒性风险中起作用。Choi等[18]研究表明，MTHFR677C>T多态性是预测MTX相关血液毒性的独立标志物。结果显示，除了血清MTX水平以外的其他因素在MTX毒性方面亦发挥作用，且MTX的肝毒性和口腔黏膜炎与血清中MTX水平无关。Xu等[19]研究了109例应用大剂量MTX治疗的患者，结果提示，在rs1801133基因型TT中，重度肝毒性或黏膜炎的发生率更高，等位基因T使严重肝毒性和黏膜炎的风险分别增加了1.98倍和2.06倍，但没有发现其与血液毒性及肾毒性存在相关性。

3.2TYMS基因 胸苷酸合成酶(TYMS)催化脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP)甲基化生成脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP)，抑制TYMS可导致脱氧胸苷三磷酸(dTTP)耗竭，从而导致染色体断裂和细胞死亡。因此，TYMS是治疗急性淋巴细胞白血病的关键酶，是MTX最重要的靶点之一。在TYMS基因中存在多种多态性，包括rs34743033、rs2853542和rs34489327。多态性rs34743033是在TYMS5′-非翻译区(5′-UTR)中有28个碱基的可变数目的串联重复序列(VNTR)。通过观察具有3个串联重复序列(3R)、2个串联重复序列(2R)或杂合基因型(3R/2R)的个体，发现VNTR3R等位基因比2R等位基因有更多的TYMS表达[20]。单核苷酸多态性(SNP)rs2853542G>C位于VNTR3R等位基因的第2次重复中。rs2853542C等位基因导致增强子破坏，降低了TYMS表达。多态性rs34489327是TYMS3′-非翻译区(3′-utr)中的1个6-bp (TTAAAG)缺失，rs344893276-bp等位基因可能改变mRNA的稳定性，降低TYMS水平。Wang等[21]对118例中国儿童进行研究，结果表明，TYMSrs2790A>G多态性的分布具有明显的民族差异，但不能证明基因型的不同可以导致血液毒性。Oosterom等[22]对112例ALL患儿进行研究，结果提示，TYMS 6-bp缺失和2R、3R多态性与MTX诱导的口腔黏膜炎无关。

3.4GGH基因 谷氨酸水解酶(GGH)是一种溶酶体酶，能够使MTX多聚谷氨酸盐(MTX-PGs)水解，并使其再次转变成游离的MTX，流出细胞外。GGH的多态性可以通过影响MTX活性，进而影响MTX的作用。GGH基因的启动子区中，-401C>T突变可以使GGH酶活性增强，从而加快细胞内MTX-PGs的水解速度，使更多的MTX可以流出细胞外。因此，CC型患者与突变型患者相比，会因为细胞内MTX-PGs的水平更高，使不良反应发生率更高。Dervieux等[27]认为，CC型患者发生不良反应的几率高于CT型和TT型患者；Ghodke-Puranik等[28]的研究显示，TT型患者的不良反应发生率更高；而Yamamoto等[29]的研究则提示，基因多态性与不良反应之间并无相关性。Koomdee等[26]研究纳入105例ALL患儿，提示GGH-401CT和TT基因型与儿童严重白细胞减少症和血小板减少症有关[30]。Yang等[31]的研究提示。GGH基因(rs719235、rs10464903、rs12681874)多态性与HD-MTX相关毒性的发生率无关。

4 MTX运载体药物遗传学

MTX的流入/流出机制取决于两个主要的超家族：溶质载体(SLC)转运体和ATP结合盒(ABC)转运体。MTX主要通过还原叶酸载体1 (RFC1)介导的主动转运进入细胞，MTX的外排主要由ABC转运体介导。RFC1的作用是双向的，但其流动能力低于ABC转运体。此外,当MTX浓度达到20 μmol/L，被动扩散可能也发挥了一定作用。研究MTX药代动力学和药效学中转运体的作用，有助于在所有MTX治疗中获得合理的应用。

4.1RFC-1基因RFC-1也称为溶质载体家族19成员1 (SLC19A1)，是MTX的转运载体，可影响MTX的抗肿瘤活性。人类RFC基因位于21号染色体q22.2～q22.3，编码包含591个氨基酸的完整膜蛋白。其中，G80A是一种常见的SNP，发生在RFC-1基因的第2个外显子中，可导致精氨酸取代组氨酸。这种替代可能干扰叶酸和MTX进入细胞的转运，并可能改变转运体的亲和力。He等[32]对儿童急性淋巴细胞白血病患者进行Meta分析，从7个方面进行研究，在血小板减少、白细胞减少、骨髓抑制、黏膜炎、肝毒性、神经毒性、血浆MTX水平方面未发现与G80A多态性存在关联，最后认为，在儿童ALL中，RFC1G80A多态性不是MTX相关毒性的良好标志物。而在Gregers等[33]对丹麦的500例白血病患儿的研究中，发现RFC80AA患者骨髓毒性更高，试验中其血小板最低点明显低于GA/GG组；而GG组的肝脏毒性更大。Kotnik等[34]的实验表明，在另一种基因多态性rs2838958中，rs2838958TT基因型患者比携带至少1个C等位基因的患者发生黏膜炎的可能性更高。

4.2 ABC转运蛋白相关基因 MTX通过细胞外排转运体从细胞中清除，不仅通过有机阴离子转运体，还通过ATP结合盒(ABC)转运体，其中ABC转运蛋白可分为8 个亚家族(ABCA-ABCG)。

4.2.1ABCB1基因ABCB1基因编码P-糖蛋白1，缩写为P-gp1或Pgp1，具有跨膜渗透泵的作用，表达在肠上皮细胞顶膜、肝细胞、肾近端小管和血脑屏障的内皮细胞。Gregers等[35]提出，在丹麦人群中，ABCB11199G>A变异与MTX在儿童所有治疗中的疗效和毒性显著相关。Ramírez-Pacheco等[36]对墨西哥患儿进行的一项研究表明，ABCB1rs1045642处的CC纯合子出现血浆中高MTX水平和白细胞减少的风险较低。此外，在黎巴嫩的一项研究中，中性粒细胞减少症与ABCB1rs1045642和rs1128503的变异等位基因携带者之间存在显著的统计学关联[37]。Liu等[38]对322例中国患儿进行研究，结果表明，与TT基因型患者相比，ABCB1rs1128503C等位基因的患者在接受HD-MTX治疗后发生口腔黏膜炎的风险更高。Dervieux等[28]发现，rs1128503与中性粒细胞减少症相关。

4.2.2ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5ABC转运蛋白的多药耐药相关蛋白(MRP)家族表达于许多屏障组织的细胞膜中，其中MRP2 (ABCC2)、MRP3 (ABCC3)、MRP4 (ABCC4)和MRP5 (ABCC5)在MTX的结合和转运中得到了广泛的研究。MRP1-4只转运单谷氨酸MTX形式，MRP5能够转运与MTX单谷氨酸类似的二谷氨酸。因此，MRP5可能导致耐药性。一项对65例B-ALL患儿进行的横断面研究，评估ABCC2基因多态性之间的关系，研究-24CT(rs717620)、1249GA(rs2273697)、3972CT(rs3740066)与MTX的血清水平和毒性的关系。结果表明，3972T等位基因携带者与肝毒性呈显著负相关，而1249A等位基因携带者的消化道毒性呈上升趋势。同时，这3种多态性与MTX血清水平无显著关系[39]。Ansari等[40]对273例ALL患儿的研究证实，ABCC3rs9895420A-189等位基因与MTX外排相关，从而降低了所有患儿的药物敏感性。结果表明，AA和AT基因型与无事件生存(EFS)的降低、血浆MTX水平的升高、中枢神经系统复发风险的升高以及2级血小板减少症的发生率较低有关。Ansari等[40]还分析了ABCC4基因中的8个SNPs。结果显示，T1393C多态性的TC基因型与更好的EFS和更低的血浆MTX水平相关。相反，A934C的CA基因型(rs2274407)与EFS减少及高级别血小板减少症发生率升高相关。此外，934CC基因型与血液毒性和提高乳酸脱氢酶(LDH)水平[5]相关。根据Den Hoed等[6]对134例ALL患儿的研究，野生型ABCC4rs7317112AA基因型的黏膜炎发生率高于AG/GG基因型。

MTX不良反应的个体差异较大，目前研究表明，ABCB1、MTHFR等基因多态性与MTX不良反应密切相关，但结果不尽相同。研究结果不同的原因可能是：①宿主因素可能是阴性结果的主要原因之一。宿主自身的疾病状况、化疗的具体用药方案、服药依从性可能降低研究结果的适用性和可靠性。②不同研究中不良反应的评价标准可能会导致结果的差异。③部分研究样本量过小，部分研究样本量过大，使得本研究可能存在严重的临床异质性。④由于随访时间和随访计划存在差异，结果可能存在差异。⑤在MTX进入机体的整个过程中，还有许多重要的因素酶和影响其代谢和排泄途径的转运体。这些基因的多态性是否为干扰因素及影响不同基因在体内的作用尚不能排除。

总之，患者的基因型应结合其他临床特征进行评估，如病理生理学、饮食、药物-药物相互作用、药物过敏和依从性，尤其是在调整药物剂量以达到最大效果和整个治疗过程的安全性方面。目前，只有少数特定的药物在临床中应用基因遗传学进行剂量调整，通常基于已知影响药物药代动力学的基因变异，已证实可以导致血浆药物水平和/或代谢物水平的改变。然而，药物遗传学研究通常是在患者有药物问题时进行的。因此，该领域的一些学者主张“先发制人的研究是解决之道”。在对MTX相关酶进行基因检测的基础上，“先发制人”地选择MTX剂量，需要更多的前瞻性随机试验来调查临床结果。寻找有效预测MTX不良反应的基因型，使临床个体化实施大剂量MTX化疗方案，减少药物相关不良反应的发生，让患儿最大程度受益。