右美托咪定对体外循环大鼠海马区脑组织TLR4蛋白表达的影响

张媛媛，周 锦，曹惠鹃，张铁铮，孙莹杰

0 引言

体外循环(CPB)是与心血管外科手术相关的主要技术，该技术可提高许多心脏病的治愈率。然而，血液与CPB设备内表面的接触，可激活补体系统，刺激促炎因子释放，从而诱发炎性反应，对机体造成伤害。目前，CPB后神经系统并发症已成为关注的焦点，其发生机制复杂，炎症性脑损害是其中一个方向[1-2]，而能有效预防CPB后神经系统损伤的药物和介入手段仍比较有限。既往研究表明，在中枢神经系统中小胶质细胞的免疫应答是通过TLR4完成的，TLR4是触发炎症反应的关键[3]。右美托咪定是一种高选择性的α2肾上腺素受体激动剂，具有镇静、抗焦虑以及轻度镇痛作用，能够减轻炎性反应，具有独特的器官保护作用[4-5]。因此，本研究通过建立大鼠无血预充体外循环模型，观察右美托咪定对体外循环大鼠血清和海马区脑组织炎性因子水平、海马区脑组织TLR4和NF-κB蛋白表达的影响，探讨右美托咪定对体外循环致大鼠脑损伤的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 成年雄性SD大鼠30只，2～3月龄，350～400 g，由北部战区总医院动物实验中心提供，且经北部战区总医院动物实验伦理委员会核准通过。大鼠在进行实验前6 h禁食，自由饮水。30只大鼠按随机数字表法分成3组，每组10只，假手术组(Sham组)：10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，行气管插管，右颈内静脉、右股静脉、左股动脉及尾动脉穿刺置管，不进行体外循环。体外循环组(CPB组)：同Sham组气管插管和动静脉置管后，行CPB 1 h。右美托咪定+CPB组(DC组)：大鼠CPB前15 min内经静脉泵注右美托咪定5 μg/kg，然后在CPB过程中以5 μg/(kg·h)的速度泵注1 h，其余同CPB组。设定4个时间点：T1 (CPB前)、T2(转流1 h)、T3(转流后2 h)、T4(转流后6 h)。

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1.2 建立大鼠CPB模型 本研究依照Chen等[6]的模型制备方法，建立无血预充大鼠体外循环非停跳模型。

作者的回复——我们感谢P.Molnar对我们工作（Parker et al，2011）的兴趣，并客气地（相当正确地）指出地壳均衡在龙门山造山带长期物质方量平衡中的潜在作用。然而，他的观点并没有影响我们的文章的主要思想，即评估与地震相关的侵蚀过程与构造过程之间的瞬时竞争。而地壳均衡又是另一个原因，除了前面我们提出的，为什么我们描述的这种瞬时不平衡可能不会保持长的时间尺度，即超过多个地震周期和黏弹性响应时间（＞1 000年）。确实，我们在我们的文章中提出，长期的岩石抬升不可能是2008年同震位移的简单函数；它是由构造活动与弯曲均衡变形的组合产生的，但每个分量的相对重要性并不是我们研究的重点。

1.3 标本采集与处理 每组按时间点经保留的右股静脉采血0.5 ml，室温下静置，10 min后离心(3 000 r/min，10 min)。留取上层血清保存在-20 ℃深低温冰柜中，供ELISA检测用。将大鼠放置于较大的托盘内，全麻状态下剪开胸骨，快速且完整分离胸腺，充分显露心脏。经左心室穿刺置管并连接300～400 ml冰盐水灌注，同时在大鼠右心耳处剪一创口，起初有红色血液流出，待流出液转为无色液体时，断头取脑。两侧均由枕骨大孔至眼眶剪开，掀开颅顶骨，剪断颅底部视神经，游离全脑并置于备好的冰袋上，迅速分离海马组织，置于冻存管中，保存在-80 ℃冰箱里，ELISA法检测IL-6、TNF-α水平，Western blot检测TLR4、NF-kB蛋白表达。

大鼠称重后，以300 mg/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠无翻转反射后固定于鼠板上，采用透光法进行气管内插管(16G套管针)，连接小动物呼吸机，设定参数。呼吸参数：FiO2=1.0，TV 3 ml/100 g，f=60/min，吸呼比1∶1.5，气道峰压9 cmH2O。穿刺部位剃毛，碘伏消毒，右股静脉处穿刺置管(22G)并连接液体进行补液；尾动脉穿刺(24G)并连接一次性压力传感器测量有创动脉血压；右颈内静脉穿刺，并将导管尖端置于心房(18G，多侧孔以便引流)；左股动脉置管(22G)用于CPB过程中血液回输。大鼠静脉注射400 IU/kg肝素钠，活化凝血时间达到400～450 s时，开始CPB。本实验采用无血预充方法制备CPB模型，因此需配置15 ml缓冲液填充CPB管路。成分：6%羟乙基淀粉12 ml、20%甘露醇1 ml、5%NaHCO32 ml和肝素钠150 IU/kg。全部CPB系统由以下各部分组成：连接颈内静脉处的血液输出管、容量为10 ml的储血槽、恒流蠕动泵、用于气体交换的膜式氧合器、连接尾动脉的输入端。储血器固定于低于大鼠心脏平面40 cm的位置，以便达到理想的引流量。将新配制的15 ml缓冲液缓慢加至CPB管路中，排空气泡。打开引流管处的开关，将血液从心房引流至储血器中，起初转流量为25～30 ml/(kg·min)，缓慢增加达到100～150 ml/(kg·min)，此时储血器中血液平面维持在3～4 ml为宜。CPB开始后将氧气接口与膜肺相连，关闭小动物呼吸机。转流期间，依照血气分析结果调整用药，使之达到MAP>60 mmHg、pH值7.35～7.45、PaCO235～45 mmHg、碱剩余(BE)-3～3 mmol/L的稳定状态。转流达到1 h后，缓慢减小转流量直至停止，启动呼吸机，重新恢复机械通气。保留右股静脉及尾动脉的套管针，以便输液和测量血压。其余管道拔除并结扎血管，缝合切口。严密监测大鼠生命体征，必要时回输管路中血液，应用多巴胺等维持血流动力学稳定。转流过程中，根据足底反射反应适量追加水合氯醛100 mg/kg。

从回归方程中，可以看出中国乳制品的进口需求价格弹性系数为0.585，需求的价格弹性小于1，需求缺乏弹性。这说明在其他条件不变的情况下，根据需求的弹性理论，即中国乳制品的价格每上升1%，则相应的乳制品进口量就下降0.585%。由此可以看出，中国乳制品进口的价格对乳制品的进口量虽然有一定影响，但影响程度不大，即价格因素并不是影响乳制品进口的关键因素，进口乳制品在中国已经占据较为稳定的市场。

2 结果

2.2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α浓度比较 T2～T4时，CPB组和DC组大鼠血清中IL-6、TNF-α浓度高于Sham组(P<0.05)，DC组大鼠血清中IL-6、TNF-α浓度低于CPB组(P<0.05)。见表2、表3。

2.1 各组大鼠血清S100-β浓度比较 T2～T4时，CPB组和DC组大鼠血清中S100-β浓度高于Sham组(P<0.05)，DC组大鼠血清中S100-β浓度低于CPB组(P<0.05)。见表1。

右美托咪定作用于蓝斑核神经元的α2AR，抑制神经冲动发生，阻断兴奋向下游传导，发挥镇静作用；通过调节神经炎症反应，明显减轻脊髓损伤后的组织损伤并改善神经系统结局[7-9]；通过抗氧化应激和调节炎性反应，能够明显减轻糖尿病大鼠短暂的全脑缺血再灌注损伤[10]。

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2.4 各组大鼠海马区脑组织TLR4和NF-κB蛋白表达比较 与Sham组比较，CPB组和DC组海马区脑组织TLR4、NF-κB蛋白表达上调(P<0.05)；与CPB组比较，DC组海马区脑组织TLR4、NF-κB蛋白表达下调(P<0.05)。见图1～图4。

表1 不同时间点各组大鼠血清S100-β浓度比较(pg/ml)

表2 各组大鼠不同时间点血清IL-6浓度比较(pg/ml)

表3 各组大鼠不同时间点血清TNF-α浓度比较(ng/ml)

表4 各组大鼠海马区脑组织IL-6、TNF-α浓度比较

图1 各组大鼠海马区TLR4蛋白表达情况

图2 各组大鼠海马区TLR4蛋白表达情况

图3 各组大鼠海马区NF-κB蛋白表达情况

3 讨论

2.3 各组大鼠海马区脑组织IL-6、TNF-α水平比较 CPB组、DC组海马区脑组织IL-6、TNF-α水平高于Sham组(P<0.05)，DC组海马区脑组织IL-6、TNF-α水平低于CPB组(P<0.05)。见表4。

图4 各组大鼠海马区NF-κB蛋白表达情况

S100-β作为脑损伤标志物具有高度特异性，对评定早期脑损害有重要价值。Kanbak等[11]对CPB下行冠状动脉搭桥手术患者研究发现，CPB能明显增加患者血清中S100-β浓度。本研究发现，CPB开始便可触发脑内S100-β释放入血，随着时间发展有明显上升趋势，右美托咪定可显著降低血中S100-β水平，减轻CPB致脑损伤。

TLR4是最先被人类研究发现的Toll样受体家族蛋白[12]，广泛存在于人类各器官免疫系统中。在中枢神经系统中，虽然两种胶质细胞均有TLR4表达，但是仅小胶质细胞表面受体与配体结合才能触发炎症反应，释放TNF-α、IL-6等炎症因子[13]。除参与炎症反应外，TLR4还介导多个重要器官的缺血再灌注损伤[14]。

体外循环脑损伤机制尚未明确，主要研究热点集中于炎症和缺血再灌注损伤。在整个脑缺血再灌注损伤病程中，脑内防御细胞，如小胶质细胞、星形胶质细胞等释放大量热休克蛋白、β淀粉样蛋白、透明质酸等作用于小胶质细胞表面并与TLR4结合，进一步激活TLR4相关信号传导通路，产生炎性物质，触发炎症反应。Hyakkoku等[15]的研究指出，大脑中动脉闭塞120 min，恢复血供1 d后，相比野生型小鼠，TLR4无功能性突变鼠的脑梗死范围明显减小，同时，缺血再灌注后的神经损害得到改善。此外，缺血再灌注后TLR4无功能性突变鼠的NF-κB p65亚基明显减少，证明TLR4基因敲除在小鼠缺血再灌注模型中发挥神经保护作用。另外，研究大鼠局灶性缺血再灌注模型发现，针刺足三里穴位能够有效对抗缺血再灌注损伤后炎症反应，减少TLR4/NF-κB通路下游TNF-α、IL-1β、IL-6的产生[14]，由此证明TLR4和NF-κB通路参与脑组织缺血再灌注损伤的发生与发展。本研究表明，体外循环后海马区脑组织TNF-α和 IL-6水平、TLR4和NF-κB蛋白表达明显增加，CPB前和CPB过程中静脉输注右美托咪定能有效下调海马区脑组织TNF-α和 IL-6水平、TLR4和NF-κB蛋白表达。有研究在大鼠败血症模型中发现，应用α2AR拮抗剂阿替美唑可对抗右美托咪定下调TLR4的作用[16]。因此，我们推测脑内右美托咪定下调TLR4和NF-κB的机制也可能与其激活α2肾上腺素受体有关。该推测有待后续研究给予证实。

综上所述，右美托咪啶通过抑制TLR4信号转导通路，减少其下游IL-6、TNF-α水平和NF-κB蛋白表达，从而发挥脑保护作用。