樱桃果醋深层液态发酵工艺

刘宝祥，苏政波，马闯，郑召运，郑伟，张作利

1. 齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省食品发酵工业研究设计院（济南 250013）；2. 山东爱樱维生态农业有限公司（日照 262300）

樱桃的营养成分非常丰富、味道鲜美，除了正常水果所含有多种维生素和矿物质等成分外，也富含花青素、各种花色苷、褪黑素、槲皮素、异槲皮素等其他成分。樱桃在预防心脑血管疾病，尤其是慢性病过程中发挥着重要作用[1-2]。由于樱桃水分高，皮薄、肉软，组织娇嫩，采摘后不易储存，导致樱桃极易变味、变质而失去价值[3]。随着樱桃产量的增加、人们对产品品质要求的提高，开发樱桃醋等高附加值、易储存的产品成为一种趋势。

果醋是以果品或加工下脚料为主要原料，利用微生物发酵技术酿制的一种营养丰富、风味优良的酸性饮品或调味品。具有抑菌、缓解体力疲劳、抗氧化、预防肥胖和高脂血症、干预酒精中毒引起的代谢失调等作用，具有广泛实用性[4-5]。果蔬酿醋和粮食酿醋相比具有营养丰富、保健价值高、风味好、更适于开发醋酸饮料等独特的优越性。通过以果代粮酿制果醋，既可以利用果蔬资源，同时又可节约粮食，对提升中国果品资源优势具有显著意义，也是酿造业发展和提升的方向之一[6]。

樱桃果醋在原有营养的基础上，果汁中的营养物质经过酵母菌和醋酸菌的发酵，更好地被人体吸收；高效萃取樱桃果浆中的生物活性物质，并富含醋酸、琥珀酸、氨基酸等生物活性成分，能够赋予樱桃更好的感官品质和经济价值[7-11]。

试验以山东日照产新鲜樱桃为原料，研究樱桃果醋的发酵工艺并通过HPLC检测有机酸的主要组成成分，为相关企业开发樱桃相关产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

樱桃（山东省日照市五莲山“红灯”樱桃）；白砂糖（市售）。

果胶酶（诺维信生物技术有限公司）；果酒酵母（湖北安琪酵母有限公司）；醋酸菌（实验室保藏）；氢氧化钠、盐酸等（分析纯）；标准品：乙酸、柠檬酸、苹果酸、D-乳酸、琥珀酸、甘油等（含量均≥99.8%，美国Sigma公司）；产品用水为纯净水。

1.2 仪器与设备

料理机（广东美的生活电器制造有限公司）；L550低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；HZT2双层振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；电热恒温水浴锅（北京医疗设备厂）；电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；HPLC色谱仪（戴安UV3000）。

1.3 测定方法

1.3.1 残糖量的测定

按照 GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》执行[12]。

1.3.2 酒精度的测定

按照 GB 5009.255—2016《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》执行[13]。

1.3.3 总酸的测定

按照 GB/T 12456—2008《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》执行[14]。

1.3.4 HPLC分析条件

色谱仪，戴安UV3000；检测器，示差检测器；色谱柱，Carbomix Ca-NP5，8%；流动相，超纯水；流速0.8 mL/min；进样量20 μL，柱温80 ℃。

1.4 樱桃果醋基本工艺

新鲜樱桃→拣选→清洗→除梗→去核→打浆→酶解→加糖→接种酵母菌→发酵→去渣→接种醋酸菌→发酵→调配→澄清→产品

醋酸菌斜面培养基：葡萄糖1 g、酵母膏1 g、琼脂2 g、碳酸钙0.5 g、无水乙醇3 mL、100 mL纯净水。

醋酸菌活化：从醋酸菌斜面，取1环接种于装液75 mL 5%vol樱桃酒的250 mL三角瓶中，于30 ℃ 200 r/min条件下培养24 h。

2 结果与分析

2.1 樱桃酒制备

取适量新鲜樱桃，去除其中的坏果、腐烂果和其他杂物，选择成熟度良好、颜色深的新鲜樱桃；手工摘除樱桃的果梗，再去掉樱桃核，称取处理好的樱桃1 kg加入料理机，直接将樱桃果进行破碎、打浆；将打浆好的樱桃加热到50 ℃，加入一定量果胶酶，保温并保持搅拌2 h；酶解好的樱桃浆，加入200 g白砂糖溶解后，加入0.3 g焦亚硫酸钠，搅拌均匀，接种0.8g果酒酵母，于24 ℃条件下静置发酵8 d，发酵结束后使用离心机以4 000 r/min离心10 min，得到上层清液；经检测，酒精度为12.51%vol，还原糖含量9.7 g/L。

2.2 樱桃果醋发酵条件的研究

2.2.1 初始酒精度对醋酸转化率的影响

取适量樱桃酒，使用无菌水稀释至需要的酒精度，分装于灭菌的三角瓶中，装液量75 mL/250 mL。分别接种5%种子液，于摇床30 ℃ 200 r/min条件下培养。

由图1可以看出，醋酸菌接种后，总酸含量缓慢上升，说明醋酸菌处于延滞期，需要一段时间的适应和菌种增值；随着发酵进行，发酵50 h总酸含量开始快速增长。初始酒精度为5%，6%，7%和8%vol的样品分别在160，150，210和240 h左右，总酸含量达到最高峰。取其总酸含量最高值，计算其最高转化率分别为65.38%，67.63%，63.36%和61.48%。初始酒精度6%vol的样品转化率最高，同时产酸速度最快。而7%和8%vol样品最终总酸含量较高，但在初期产酸速度较慢，说明酒精度提高可能会抑制醋酸菌的活性，造成延滞期的延长，进而影响产酸速度，造成发酵时间延长，再加上酒精挥发，从而造成醋酸转化率较低。所以，初始酒精度选择6%vol。

图1 不同初始酒精度对总酸含量的影响

2.2.2 接种量对发酵的影响

取适量樱桃酒，使用无菌水稀释至酒精度6%vol，分装于灭菌的三角瓶中，装液量75 mL/250 mL。分别接种3%，4%，5%，6%和7%种子液，于摇床30 ℃200 r/min条件下培养。

由图2可以看出，接种量对发酵速度有很大影响。接种量较小（3%种子接种量）时，初期产酸速度较慢；随着接种量增大，产酸速度随之增加；发酵后期，转化率均可达到75%，但接种量较高也会造成后期的酸度损失变大。所以，考虑综合因素，接种量选择5%。

图2 不同接种量对总酸含量的影响

2.2.3 发酵温度的影响

取适量樱桃酒，使用无菌水稀释至酒精度6%vol，分装于灭菌的三角瓶中，装液量75 mL/250 mL，接种5%种子液，分别于26，28，30，32和34 ℃条件下摇床200 r/min培养。

醋酸菌必须在合适的生长温度条件下才能发挥最好作用[15]。温度过低会造成发酵产酸速度过慢，温度过高会造成醋酸菌的提前老化，也会影响产酸的速率。由图3可以看出，发酵温度较低时（26 ℃），醋酸菌产酸速度较慢，造成发酵时间延长，发酵周期的延长同时提高生产成本也加大后期风险。温度较高时（34 ℃），发酵初期产酸速度较快，但随着发酵进行，酒精和醋酸的挥发造成产酸率较低和资源的浪费。所以，发酵温度选择28 ℃。

图3 不同发酵温度对总酸含量的影响

2.2.4 摇床转速和时间对发酵的影响

取适量樱桃酒，使用无菌水稀释至酒精度6%vol，分装于灭菌的三角瓶中，装液量75 mL/250 mL，接种5%种子液，在28 ℃条件下分别于摇床转速160，180，200，220和240 r/min培养。

由图4可知，摇床转速对发酵产酸速率的影响不大，说明在试验范围内达到菌体生长和乙醇酸化所需氧气量。转速较低时，发酵产酸速度较慢；随着转速增加，产酸速度加快，最终醋酸的转化率差别不大。综合考虑选择摇床转速220 r/min，培养时间192 h基本达到总酸最大值。

图4 不同摇床转速对总酸含量的影响

2.2.5 樱桃果醋发酵条件验证试验

取适量新鲜樱桃，去除其中的坏果、腐烂果和其他杂物，选择成熟度良好、颜色深的新鲜樱桃；手工摘除樱桃的果梗，去除樱桃核，处理好的樱桃称取1 kg加入料理机，直接将樱桃果进行破碎、打浆；打浆好的樱桃，加热到50 ℃，加入一定量果胶酶，保温并保持搅拌2 h；酶解好的樱桃浆，加入200 g白砂糖溶解后，加入0.3 g焦亚硫酸钠，搅拌均匀，接种0.8 g果酒酵母，于24 ℃条件下静置发酵8 d，发酵结束后使用离心机以4 000 r/min离心10 min，得到上层清液；经检测，酒精度12.51%vol，还原糖含量9.7 g/L。取适量樱桃酒，使用无菌水稀释至酒精度6%vol，分装于灭菌的三角瓶中，装液量75 mL/250 mL，接种5%种子液，28 ℃条件下于摇床转速220 r/min培养192 h，检测总酸含量为46.38 g/L。

综上所述，樱桃果醋摇床发酵最佳工艺为：初始酒精度6%vol，接种量5%，最适温度28 ℃，摇床转速220 r/min，培养192 h左右。

2.3 5 L发酵罐放大培养

取适量樱桃酒，使用无菌水稀释至酒精度6%vol，倒入发酵罐，装液量3 500 mL，通入无菌空气并保持搅拌。接种5%种子液，28 ℃条件下，保持通气量0.2 L/（L·h），搅拌转速250 r/min条件下进行培养。

结果表明，樱桃果醋的总酸生成速率为0.49 g/（L·h），最终醋酸转化率为79%，发酵时间为96 h。与摇床发酵相比，发酵时间缩短96 h，转化率提高2%，说明在5 L发酵罐中，供氧方式的改变对提高醋酸菌的生长和产酸效率有着很好促进作用。醋酸菌为严格好氧菌，通气量对发酵效率具有重要影响。

通过检测发酵过程中溶氧的变化，发现发酵16 h内溶氧较高，在此之前发酵产酸速度低于0.20 g/（L·h）；16 h后溶氧开始降低，发酵36～48 h的产酸速度达到0.83 g/（L·h）；随后逐渐维持平均速度，说明发酵0～16 h为醋酸菌生长的延滞期，主要完成菌种的适应和菌体生长，耗氧量较小，16～36 h完成菌体增殖，大量产酸，达到稳定期，可以适当调高搅拌转速，满足醋酸菌需求，直至发酵结束。

2.4 樱桃果醋的有机酸种类分析

通过对樱桃汁、樱桃酒和樱桃果醋进行高效液相色谱分析，发现樱桃果醋中的有机酸为乙酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和乳酸，其中，柠檬酸、苹果酸、乳酸在原始樱桃中天然存在；在酵母菌发酵过程中产生少量琥珀酸，醋酸菌发酵过程主要产生的有机酸为乙酸，约占总酸量的90%。这些有机酸共同组成樱桃果醋的主要风味成分。

3 结论

通过试验，确定樱桃果醋的摇床发酵最佳工艺为：初始酒精度6%vol，接种量5%，温度28 ℃，摇床转速220 r/min，培养192 h左右；5 L发酵罐放大培养，醋酸转化率为79%，发酵时间为96 h；与摇床发酵相比，转化率提高2%，发酵时间显著缩短；通过高效液相色谱检测，樱桃果醋的主要有机酸成分为乙酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和乳酸。最终发酵的樱桃果醋酸度为4.73 g/100 mL，感官指标、理化指标及微生物指标均符合相关国家标准。得到的樱桃果醋为呈深红色、具有显著的樱桃香气和醋香、无肉眼可见沉淀及悬浮物、无异味。初步确定樱桃果醋的工业化生产条件，为樱桃果醋产业化发展提供参考和借鉴。