不同培养条件对vero细胞的增殖及其检测病毒含量的影响

吉哈利，王玉恒，于子淇

（西藏自治区兽医生物药品制造厂，西藏 拉萨 850000）

非洲绿猴肾细胞（vero细胞），是一种从非洲绿猴肾上皮细胞分离出来的异倍体细胞[1]。1962年，日本学者Y.Yasumura和Y.Kawakita分离培养出此细胞系[2，3]，具有生长速度快、连续传代、遗传稳定、对病毒广泛适应谱等优点，也是经世界卫生组织（World health Organization，WHO）和《中国药典》认可的应用于人用疫苗和动物疫苗的细胞系，故迅速推动了该细胞系应用于病毒性疫苗、基因工程疫苗等生物制品。现已广泛作用于乙型脑炎、轮状病毒、小反刍兽疫病毒等疫苗的细胞基质[4，6]。因此vero细胞在生物制品研发过程中具有非常重要的作用。

迄今为止，对vero细胞的培养条件以及在动物疫苗研发等方面的研究越来越多。例如，S.F.Chun等[7]开发适用于悬浮液的vero细胞培养工艺技术，从而有利于病毒疫苗研发；R.Samia等[8]研究发现狂犬病毒接种于悬浮培养vero细胞中可获得高滴度病毒；Y.Wu等[9]研究发现了猪流行性腹泻病毒在vero细胞多次传代后可获得弱毒株；薛俊欣等[10]研究发现DMSO体积分数低于1%时对vero细胞无明现毒性；韩伟等[11]研究发现猪乙型脑炎病毒接种于vero细胞培养96 h后，可获得较高滴度的病毒。本试验研究了在不同培养条件下对vero细胞增殖及其检测病毒含量的影响，初步验证了培养vero细胞的最佳培养时间和最佳血清浓度，为生物制品的研发提供一定理论依据。

1 材料

1.1 细胞及疫苗来源

Vero细胞来源于中国兽药监察所，并经过连续传代培养至5代后进行试验。小反刍兽疫活疫苗（clone 9株）来源于西藏自治区兽医生物药品制造厂且已获得国家批号，其病毒效价为103.5 TCID50/头份。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM （C11960500BT)、PBS缓冲液（C14190500BT）、胰酶（25200-072）、胎牛血清FBS（16000-044）均购于美国Gibco公司，Cell Counting Kit-8（C0037）购于北京碧云天生物科技公司，其他分析纯均为国产。二氧化碳培养箱（MCO-15AC，日本三洋电机株式会社产品）、体视显微镜（CX21FS1C，奥林巴斯工业有限公司产品）、倒置显微镜（DSZ5000X，重庆奥浦光电技术有限公司产品）、酶标分析仪（DNX-9620，北京普朗新技术有限公司）、台式高速冷冻离心机（TGL16LMB，湖南星科科学仪器有限公司）、电热恒温水浴锅（HH-2A，北京科伟永兴仪器有限公司），其他实验耗材均为美国Corning公司产品。

2 方法

2.1 vero细胞复苏及传代

从液氮罐中取出冻存vero细胞，放置于37 ℃恒温水浴锅中迅速解冻，吸至已加37 ℃培养液的无菌离心管中，离心后弃掉上清液。重新加入37 ℃培养液，轻轻吹打混匀，血细胞计数板进行计数，调整细胞密度为4～5×105个/ml，接种于已加37℃培养液的75cm2培养瓶中，于37℃、5 %CO2培养箱中培养。当细胞生长至75cm2培养瓶壁80%～90 %时，弃掉上清培养液，用PBS清洗vero细胞2～3次，除去死细胞及异物。加入4 ml胰酶放置37℃培养箱消化2～3 min，再加入37℃培养液终止消化，用于接种96孔板。

2.2 CCK-8法检测细胞增殖

Vero细胞消化后，离心后弃掉上清液，重新加入37℃培养液，轻轻吹打混匀，血细胞计数板进行计数，调整细胞密度为1×104个/ml，接种于96孔板。本试验设立3个试验组，分别为DMEM、DMEM+5 %FBS、DMEM+10 %FBS，每组设5个重复孔，其余孔加入100 ul PBS，于37 ℃、5 %CO2培养箱中培养24 h、48 h、72 h、96 h。培养到规定时间后，细胞培养液更换为含10 %CCK-8试剂的细胞培养液，在37℃、5%CO2培养箱继续孵育2.5 h，然后用酶标分析仪检测波长450 nm时其吸光度OD值，并计算重复孔平均值。

2.3 TCID50测定

Vero细胞消化、离心后，调整细胞密度为1×104个/ml，接种96孔板，于37℃、5 %CO2培养箱中培养1～2 h后进行同步接毒。本试验设立两个试验组，分别为DMEM+5 %FBS和DMEM+10 %FBS，每组设3个重复。取出待测活疫苗，按疫苗说明书稀释疫苗为1头份，再进行10倍梯度稀释至1×10-4，并设立阴性对照，滴加入96孔板，于37℃、5%CO2培养箱中培养72 h、96 h、120 h、144 h。培养到规定时间后，观察细胞病变情况，然后采用Reed-Muench法计算TCID50。

2.4 数据分析

采用SPSS 19.0软件包中One-way ANOVA对数据进行差异显著性分析。试验统计数据均为平均值±标准误（Mean±SD）表示。

3 结果

3.1 不同培养时间对vero细胞增殖的影响

为探究培养时间对vero细胞增殖的影响，因此本试验利用CCK-8方法分别检测了vero细胞培养24 h、48 h、72 h和96 h后细胞增殖的情况。结果表明：培养时间的差异对vero细胞增殖有显著作用。由图1可知，在DMEM培养条件下，vero细胞培养72 h的细胞增殖显著高于培养24 h、48 h，但与培养96 h的细胞增殖差异不显著。由图2可知，在DMEM+5 %FBS培养条件下，vero细胞的增殖趋势呈逐渐递增，与DMEM培养条件下细胞增殖趋势相同。由图3可知，在DMEM+10 %FBS培养条件下，vero细胞培养96 h的细胞增殖显著高于培养24 h、48 h、72 h。

图1 在DMEM培养条件下，不同培养时间对vero细胞增殖的影响

图2 在DMEM+5%FBS培养条件下，不同培养时间对vero细胞增殖的影响

图3 在DMEM+10%FBS培养条件下，不同培养时间对vero细胞增殖的影响

3.2 不同血清浓度对vero细胞增殖的影响

为探究培养液中血清浓度对vero细胞增殖的影响，因此本试验利用CCK-8方法分别检测了vero细胞在DMEM、DMEM+5 %FBS、DMEM+10 %FBS培养条件下细胞增殖的情况。结果表明：在培养液中添加不同浓度的血清对vero细胞增殖有显著作用，其中在vero细胞培养24 h时，不同血清浓度对细胞增殖的影响不显著（见图4）；在vero细胞培养48 h时，DMEM+5 %FBS组的细胞增殖显著高于DMEM组，但与DMEM+10 %FBS组差异不显著（见图5）；在vero细胞分别培养72 h和96 h时，DMEM+10 %FBS组的细胞增殖均显著高于DMEM组、DMEM+ 5 %FBS组（见图6、图7）。

图4 在培养24 h时，不同血清浓度对vero细胞增殖的影响

图5 在培养48 h时，不同血清浓度对vero细胞增殖的影响

图6 在培养72 h时，不同血清浓度对vero细胞增殖的影响

表1 不同血清浓度对vero细胞检测病毒含量的影响

图7 在培养96 h时，不同血清浓度对vero细胞增殖的影响

3.3 不同血清浓度对vero细胞检测病毒含量的影响

为研究培养液中血清浓度对vero细胞检测病毒含量的影响，因此本试验利用TCID50法计算vero细胞在5 %FBS和10 %FBS培养条件下检测病毒含量的情况。结果表明在5 %FBS和10 %FBS培养条件下，vero细胞检测活疫苗TCID50值的差异不显著（见表1）。

4 讨论

Vero细胞是日本学者Y.Yasumura和Y.Kawakita于1962年从非洲绿猴肾脏分离的异倍体贴附依赖性细胞，并培养出细胞系和不同代次的细胞库[2，3]。1987年，WHO正式批准vero细胞系可作为生物制品生产的基质，迅速推进了人用疫苗和动物疫苗的研发。例如，Barrett等[12]利用vero细胞生产首个人用疫苗—脊髓灰质炎灭活疫苗；R.Samia等[8]研究发现狂犬病毒接种于悬浮培养Vero细胞中可获得高滴度病毒；Y.Wu等[9]研究发现了猪流行性腹泻病毒在vero细胞多次传代后可获得弱毒株；薛俊欣等[10]研究发现DMSO体积分数低于1%时对vero细胞无明现毒性；韩伟等[11]研究发现猪乙型脑炎病毒接种于Vero细胞培养96 h后，可获得较高滴度的病毒。因此在生物制品研发过程中vero细胞具有不可替代的作用。

为了验证vero细胞的培养条件，因此本试验研究了在不同培养条件下，vero细胞的增殖及其检测病毒含量的情况。首先，通过CCK-8方法检测了不同培养时间对vero细胞增殖的影响，结果表明培养时间的差异对vero细胞增殖有显著作用。当培养72 h时的细胞增殖趋势呈逐渐递增，但72 h之后增殖趋势较平缓，也进一步说明vero细胞最佳培养时间为72 h；然后，利用CCK-8方法检测了不同血清浓度对vero细胞增殖的影响，结果表明：在培养液中添加不同浓度的血清对vero细胞增殖有显著影响。当vero细胞培养72 h时，添加10%血清的细胞增殖显著高于不添加血清和添加5%血清，也进一步说明vero细胞最佳血清浓度为10 %；最后利用TCID50法检测培养液中血清浓度对vero细胞检测病毒含量的影响，结果表明：在添加5%血清和10%血清培养条件下，vero细胞检测活疫苗TCID50值的差异不大，也进一步说明vero细胞检测活疫苗病毒含量受培养液血清浓度的影响不大。综上所述，本试验初步验证了培养vero细胞的最佳培养时间和最佳血清浓度，为生物制品的研发奠定基础。