广州地区无偿献血者CD36缺失频率及血小板输注治疗

蔡碧红 王嘉励 叶欣 付涌水 周振海

1中山大学附属第一医院（广州510080）；2广州血液中心（广州510080）

CD36 又称为血小板糖蛋白4（GPⅣ），或血小板反应蛋白（TSP）、Naka 受体等，是分子量为88 kD 的单链跨膜表面糖蛋白，属于B 类清道夫受体跨膜蛋白家族，广泛分布于人微血管内皮细胞、单核/巨噬细胞、红系前体细胞、肝细胞、脂肪细胞等［1］，参与脂质代谢、胰岛素抵抗、炎症、动脉粥样硬化和血栓形成等生理病理过程［2］。部分人群不表达CD36，根据CD36 表达缺失部位不同分为2 种类型：血小板和单核细胞均缺乏CD36 表达为Ⅰ型，仅在血小板上缺乏表达为Ⅱ型［3］。既往对CD36 的研究多集中在血管形成、血栓形成、动脉粥样硬化、冠心病等方面，但随着临床研究的开展，发现CD36 表达缺失的个体可能通过输血、妊娠、器官移植等途径刺激机体产生抗CD36 同种免疫抗体，导致血小板输注无效、输血后紫癜、流产、新生儿同种免疫血小板减少症。据报道，CD36 表达缺失主要发生在亚洲和非洲人种，而在白种人中罕见。为了解广州地区献血人群CD36 表达缺失情况及建立已知CD36 抗原表型的血小板供者库，笔者对广州地区无偿献血者进行了CD36 表达的筛查。通过对1 485 例无偿献血者CD36 缺失情况的分析，了解广州地区CD36 表达缺失的频率，为进一步探索CD36 抗体导致的血小板输注无效奠定基础。同时，对2 例CD36 抗体阳性的血小板输注无效的临床病例给予CD36 抗原阴性的血小板输注，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料血液标本来自广州血液中心的1 485 例健康固定无偿献血者（累积捐献血小板≥3次）。留取静脉全血10 mL/例（EDTA 抗凝），采集血样前均获得献血者的知情同意。2 例临床病例为送广州血液中心进行血小板配型的血小板输注无效患者。病例1 为女性，35 岁，A 型血型，骨髓增生异常综合征患者，输血史＞10 次，在输注随机机采血小板后出现血小板输注无效（24 h 校正血小板增加指数（corrected count increment，CCI）＜4.5），伴有全身散在出血点。病例2 为男性，46 岁，B 型血型，酒精性肝硬化失代偿期，肝移植半年后，腹腔感染入院，住院期间曾使用多种抗生素，输血史＞10 次，在输注随机机采血小板后出现血小板输注无效（24 h CCI＜4.5），并伴有眼结膜下片状出血，全身散在出血点，以双下肢明显。

1.2 试剂和仪器FITC 荧光标记的抗人CD36 单克隆抗体（批号mabFA6.152）和PE 荧光标记抗人CD14 单克隆抗体（mab RMO52）（法国Beckman CouLter 公司）；ELISA 试剂盒（PAKPLUS，美国GTI Diagnostics 公司），MASPAT kit试剂盒（荷兰Sanquin公司）；离心机（久保田5220，日本久保田公司）；流式细胞仪（BD FACSCantoTMⅡ，美国BD公司）。

1.3 血小板的分离10 mL 抗凝全血经100g离心15 min 后，分离出上层3/4 的富血小板血浆，并使用EDTA/PBS 缓冲液洗涤3 次，洗涤过的血小板重悬于EDTA/PBS 缓冲液并调整浓度使其达到1.0×105PLT/μL。

1.4 流式细胞术分析CD36 在血小板和单核细胞上的表达取50 μL 上述血小板悬液，加入10 μL FITC 荧光标记的抗人CD36 单克隆抗体，室温孵育30 min。洗涤后，标记的血小板重悬于1 mL EDTA/PBS 缓冲液中，上流式细胞仪检测CD36 的表达。取100 μL EDTA 抗凝全血，加入10 μL FITC 荧光标记的抗人CD36 单克隆抗体和PE 荧光标记的CD14 单抗，室温孵育20 min。随后加入500 μL 裂解液，室温孵育20 min 以去除红细胞，加入4 mL EDTA/PBS缓冲液洗涤2次后，重悬于500 μL EDTA/PBS 缓冲液，用流式细胞仪检测CD36 的表达。

1.5 ELISA 鉴定血小板同种抗体特异性按照ELISA 试剂盒说明书操作鉴定CD36 抗体，在包被有不同血小板糖蛋白（HLAⅠ类、GPⅡb/Ⅱa、GPⅠa/Ⅱa、GPⅠb/Ⅸ和GPIV）的微量滴定孔中加入50 μL 稀释血清（1∶3）。用碱性磷酸酶标记的抗人IgG（稀释度1∶100）检测结合抗体。抗体的特异性通过抗原捕获ELISA 来确定。

1.6 血小板交叉配型2 例检测出血小板CD36抗体阳性患者的血液标本，与CD36 抗原阴性的血小板供者库中的6 个单采血小板使用MASPAT kit试剂盒及罗广平等自制的血小板交叉配型试剂盒［4］进行交叉配型，并选择相配合的CD36 抗原阴性的血小板进行输注。

1.7 输注疗效评价根据患者输注前后CCI、血小板回收率（percentage platelet recovery，PPR）以及出血状况有无改善综合判断。CCI=［（输注后PLT-输注前PLT）（109/L）×体表面积（m2）］/［输注PLT 总数（1011/L）］；PPR=［（输注后PLT-输注前PLT）（109/L）×血容量（L）］/［输注PLT 总数（1011/L）］×100%。体表面积=0.006 1×身高（cm）+0.012 8×体质量（kg）-0.152 9，血容量=体表面积（m2）×2.5。输注血小板后24 h CCI≥4.5、PPR≥20%以及出血症状明显改善为输注有效，否则视为输注无效［5］。

2 结果

2.1 流式细胞仪分析CD36 缺失情况在本次纳入研究的1 485 例广州地区健康无偿献血者中，共筛选出33 例血小板表面CD36 缺失的个体，其中17 例为血小板和单核细胞表面CD36 均缺失的个体，即CD36 表达缺失频率为2.22%（33/1 485），其中Ⅰ型缺失所占比例为51.52%（17/33），Ⅱ型缺失所占比例为48.48%（16/33）。

2.2 2 例血小板输注无效（PTR）患者血小板和单核细胞表面CD36 抗原表达情况流式细胞术检测2 例PTR 患者血小板和单核细胞表面均缺乏CD36 表达，证实2 例患者均为CD36Ⅰ型缺失。

2.3 2 例PTR 患者血小板抗体检测采用ELISA的方法检测患者血清中的血小板抗体，HLAⅠ类、GPⅡb/Ⅱa、GPIa/Ⅱa、GPIb/Ⅸ孔均为阴性，仅GPⅣ孔为阳性，证实2 例患者血清均仅存在抗CD36抗体。

2.4 PTR 患者交叉配型血小板输注效果观察在分别给予输注相配合的CD36 抗原阴性的单采血小板后，病例1 血小板计数明显升高，24 h CCI 为35.84（≥4.5），PPR 为89.6%（≥20%）；病例2 全身未见新发出血点，且球结膜片状出血逐渐吸收消退，全身出血点也消退好转，其24 h CCI 为10.24（≥4.5），PPR 为25.6%（≥20%）。见表1。

表1 2 例PTR 患者输注CD36 抗原阴性单采血小板后24 h CCI、PPR 及出血状况改善情况Tab.1 Improvement of 24 h CCI，PPR and bleeding status after transfusion of CD36 antigen negative platelets in 2 PTR patients

3 讨论

血小板输注是针对各种原因导致的血小板数量或功能异常患者预防或治疗出血的重要手段之一，但是多次甚至是频繁输注血小板会导致有效率减低［6］，易引起PTR。PTR 是指患者在连续2 次接受足够剂量的血小板输注后，仍处于无反应状态，临床出血表现未见改善，血小板计数未见明显增高，有时反而下降。PTR 往往与住院时间延长、住院费用增加［7］、出血风险增加［8］、生存率降低［9］等一系列不良事件相关。导致PTR 的原因包括非免疫性因素（感染、高热、抗生素、脾肿大、肝素等）和免疫性因素，包括人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）、人类血小板抗原（human platelet antigen，HPA）和CD36 抗原等引起的抗原抗体反应［10］。引起PTR 的免疫原因是患者由于既往的输血、妊娠、移植等产生了对供者血小板的同种异体免疫反应，主要是针对人类白细胞抗原及血小板抗原［11］。第1 例被报道的CD36 抗原缺失导致的PTR 的病例来自1989年IKEDA 等［12］发现的1 例急性髓系白血病的女性患者，在输注了HLA 配型的血小板后出现了PTR，其血清被检测出抗-Naka 抗体，在输注了Naka 阴性的血小板后其血小板计数得到了升高。随后，陆续有研究报道了CD36 抗体介导的胎儿/新生儿血小板减少症［13］、输血相关急性肺损伤［14］等病例。CD36 缺失情况在不同地域、民族之间有很大区别，缺失主要发生在有色人种，亚洲地区发生率为3%～11%，非洲裔美国人约为8%，而高加索人不到0.3%［15］。中国处于亚洲CD36 表达缺失高发生率的地区，由CD36 抗体导致的PTR 同样不容忽视。目前国内已有成都、长春、上海、江苏等地区对CD36 表达缺失情况进行了调查分析，广东地区亦有相关报道，但相对例数较少，因此笔者进一步增加了调查的样本量。通过筛查广州地区1 485 名健康献血者CD36 表达情况，以了解本地区人群CD36 表达缺失情况及建立已知CD36 表型的血小板供者库，为临床CD36 抗体介导的PTR 患者提供CD36 抗原阴性的血小板。

本研究在广州地区1 485 名健康无偿献血者中，共筛查出33 例CD36 缺失的个体，即CD36 表达缺失频率为2.22%（33/1485），其中Ⅰ型缺失频率为1.14%，Ⅱ型缺失频率为1.08%。MA 等［15］对北方地区人群的筛查中发现，612 例受试者中有13例出现Ⅱ型CD36 缺乏，频率为2.12%。于晓丽等［16］对长春地区435 名无偿献血者CD36 表型的筛查中，发现该地区CD36 缺失频率为3.45%，Ⅰ型和Ⅱ型的缺失频率分别为0.2%、3.2%。钟周琳等在4 621 名广西地区人群筛查中发现CD36 的总体缺失率是4.13%，其中汉族人群的缺失率为3.59%、壮族为5.76%、瑶族为2.38%［17］。而PHUANGTHAM 等［18］在泰国700 名献血者的调查分析中发现CD36 缺失频率为2.14%，Ⅰ型和Ⅱ型CD36 缺失的发生率分别为0.43%和1.71%。之所以本研究结果和上述报道有所不同，可能与不同地区，不同民族CD36 缺失的频率不同有关。此外，既往部分报道除了对CD36 表达缺失的频率进行了调查，同时也分析了CD36 基因突变的位点。而CD36 的基因检测作为CD36 相关研究的热点问题，是本研究所欠缺的也是下一步要继续深入研究和探讨的。

本研究报道的2 例CD36 抗体介导的PTR 病例，患者既往都有多次的血小板输注史，在输注随机机采血小板后，血小板计数没有得到明显提升，临床出血症状未见改善。经检测，2 例患者血清中仅有CD36 抗体，且血小板和单核细胞上均缺乏CD36 表达，证实2 例患者均属于Ⅰ型CD36 缺失。目前的研究认为，产生CD36 抗体通常来自于Ⅰ型CD36 缺乏人群，而Ⅱ型CD36 缺乏者不会产生抗CD36 抗体［19］。随后，笔者给予2 例患者输注CD36抗原阴性的血小板，血小板计数均得到了提升，临床出血症状亦明显改善。这2 个临床病例证实了通过输注CD36 抗原阴性的血小板确实能够改善血小板输注的有效率。除了输注交叉配型的CD36 抗原阴性血小板的治疗策略，还有病例报道表明用静脉注射用免疫球蛋白和利妥昔单抗进行免疫抑制治疗也可以改善PTR 的问题［20］。

尽管目前仅发现少数PTR 病例是由于CD36抗体所致，但其重要性仍不可忽视。临床遇到高度怀疑免疫因素导致的PTR 病例时，除了常规筛查HLA 抗体和HPA 抗体外，还应该将CD36 抗体也纳入考虑。若检测到CD36 抗体，应检测患者血小板和单核细胞上CD36 表达情况，并给予CD36抗原阴性的血小板输注。同时，有条件的采供血机构应建立CD36 阴性的血小板供者库，以便能够及时为CD36 抗体介导的PTR 的患者提供相合的血小板，以提高输血效果、减少出血风险和保证输血安全。