宁夏布鲁氏菌多位点串联重复序列分型研究

马学平，高建炜，韩 坤，杨 聪，海 娥，朴东日，姜 海，崔步云，赵建华

布鲁氏菌属(Brucella)细菌是引起布鲁氏菌病(Brucellosis)的病原体[1]，目前分为6个种19个生物型[2]，羊种、猪种和牛种是感染人体的主要种型[3]，羊种是我国主要的感染人体种型[4]。布鲁氏菌由于具有广泛的宿主和遗传多样性，其种间核苷酸序列一致性在99%以上[5]，传统方法分型烦琐，具有生物安全风险。多位点串联重复序列分析(MLVA)技术具有简单、快速、分辨率高、重复性好等特点，被广泛应用于布鲁氏菌分型中[6-9]，是流行病学调查溯源的补充方法。本研究采用多位点串联重复序列分析方法对宁夏68株布鲁氏菌进行分型研究，阐述其分子特征，为布鲁氏菌病疫情暴发溯源提供基础资料。

1 资料与方法

1.1 一般材料：44株临床分离菌株于2009-2013年从宁夏地区感染布鲁氏菌现症病人血液样本中分离获得，历史保藏的24株菌株和16M、544A、1330S参考菌株由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所布病研究室提供，菌株鉴定与MLVA分型实验在中国疾病预防控制中心传染病预防控制所完成。

1.2 试剂与仪器：法国BioMerieux,SA公司生产的双相血培养瓶；上海生工生物工程股份有限公司合成的AMOS-PCR引物、MLVA-16引物，北京天一辉远生物科技有限公司完成测序；DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂购自北京天根生化科技有限公司。仪器设备S1000TM型基因扩增仪、Universal HoodⅡ型凝胶成像仪由BIO-RAD 公司生产；DDY-6C 型电泳仪由北京六一厂生产。

1.3 方法

1.3.1 布鲁氏菌培养分离：负压双相血培养瓶采集具有牛羊等动物接触史、临床症状和经血清学确诊为感染布鲁氏菌急性发作期病人血液3～5 mL，轻轻振荡血培养瓶使液相培养基与血液充分混匀置于37 ℃恒温培养箱中培养，每隔1 d观察1次血培养瓶生长情况，并倾斜培养瓶使液相培养物浸没固相培养基表面。如果固相培养基表面观察到菌落生长时，挑取可疑菌落接种于布氏琼脂平板传代培养，如果液体浑浊挑取1环培养液接种于布氏琼脂平板传代培养观察；如果无菌生长则继续培养至30 d 左右，仍无菌生长，则高压灭菌后按医疗废弃物处置。

1.3.2 布鲁氏菌鉴定

1.3.2.1 传统生物学特性鉴定:根据培养特性、二氧化碳需求、菌落生长时间和形态观察，革兰氏染色和柯氏染色初步判定布鲁氏菌。接种观察硫堇、碱性复红染料抑菌试验，A、M(血清)单相特异性凝集和粗糙型R(血清)凝集试验，Tb、BK2、Wb(噬菌体)裂解试验。

1.3.2.2 AMOS-PCR方法鉴定: AMOS-PCR(AMOS是牛、羊、绵羊附睾和猪种布鲁氏菌的英文名称的第一个字母)引物按参考文献的方法合成[10]。PCR反应体系:10×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl,引物各0.5 μl(10 μmol/L)，Taq 酶1 μl(2.5 U),模板1 μl，去离子水14.5 μl。PCR反应程序:93 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，60 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min,共40个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，凝胶成像分析仪拍照分析。

1.3.3 MLVA分型：分型引物及扩增体系参考文献[7]。MLVA反应体系：10×缓冲液2.5 μl，dNTP 2 μl(2.5 mmol/L)，Taq 酶1 μl(2.5 U/μl)，引物各1 μl(10 pmol/μl)，DNA 模板1 μl，用灭菌蒸馏水补至25 μl。扩增参数:95 ℃ 预变性5 min，然后以 95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，进行40个循环。PCR产物电泳得到产物片段的大小，送基因公司进行毛细血管电泳测序。

1.4 统计学方法：根据 PCR 产物大小换算为重复单位数，采用 Bio Numerics 5.0软件，利用非加权配伍组平均法(UPGMA)进行聚类分析。

2 结果

2.1 传统生物学特性鉴定结果：利用双相血培养瓶分离到可疑布鲁氏菌后经单项特异性血清A、M和R凝集，染料抑菌，噬菌体裂解，CO2需求，H2S等试验鉴定，近期临床分离44株菌均为羊种生物3型布鲁氏菌。历史保藏菌株鉴定结果为：12株羊种布鲁氏菌、3株牛种布鲁氏菌和9株猪种布鲁氏菌，见表1。

表1 宁夏布鲁氏菌分离株生物学特性鉴定结果

菌株编号阳性血清特异性凝集血清RAM噬菌体裂解TbWbBK2菌株种/型分离地点宿主NX201209+-++--+羊3吴忠市病人NX201210+-++--+羊3吴忠市病人NX201301+-++--+羊3吴忠市病人NX201302+-++--+羊3银川市病人NX201303+-++--+羊3吴忠市病人NX201304+-++--+羊3吴忠市病人NX201305+-++--+羊3吴忠市病人NX201306+-++--+羊3吴忠市病人NX201307+-++--+羊3盐池县病人NX201308+-++--+羊3吴忠市病人NX201309+-++--+羊3吴忠市病人NX201310+-++--+羊3盐池县病人NX201311+-++--+羊3盐池县病人NX201312+-++--+羊3盐池县病人NX201313+-++--+羊3盐池县病人NX201314+-++--+羊3盐池县病人NX201315+-++--+羊3盐池县病人NX201316+-++--+羊3盐池县病人NX201317+-++--+羊3平罗县病人NX201318+-++--+羊3平罗县病人NX201319+-++--+羊3盐池县病人NX201320+-++--+羊3吴忠市病人NX201321+-++--+羊3盐池县病人

2.2 AMOS-PCR鉴定结果：采用AMOS-PCR鉴定布鲁氏菌，结果显示羊种布鲁氏菌均扩增出2条特异性片段，大小为731 bp和178 bp，牛种布鲁氏菌扩增出2条特异性片段，大小为498 bp和178 bp，猪种布鲁氏菌扩增出2条特异性条带，大小为285 bp和178 bp。

2.3 MLVA分型结果：采用 MLVA-16 分型方法对68株布鲁氏菌进行分析，经扩增电泳检测合格后，PCR产物送公司进行毛细管电泳测序，用Bio Numerics 4.0软件聚类分析后，按照相似度80%划分，68株菌可被分为8大基因群、39个基因型。从种群分布看，68株菌按种分为3大群，56株羊种布鲁氏菌共分为33个基因型，最多的在同一基因型中有7株布鲁氏菌。9株猪种布鲁氏菌分为3个基因型，3株牛种布鲁氏菌分为3个基因型。在地区分布上具有明显的地域性，近期分离羊种布鲁氏菌各市、县大部分均能处在同一基因型，尤其是吴忠市和盐池县分离的菌株均能聚在一起，平罗县和红寺堡各分离2株菌均处在同一基因型。

结合流行病学资料发现吴忠市分离的菌株NX201201和NX201206，NX201303和NX201305同为一家人，具有同样的接触史、发病时间，且分离菌株时间相同，与流行病学调查结果吻合。从时间分布看，近期分离的菌株大部分聚在一起，历史菌株中发现NX79033、NX79085与近期红寺堡分离菌株NX200905、NX201001处在同一基因型，提示具有本土传染源引起感染存在的可能性。

3 讨论

随着畜牧业的发展，布病疫情有回升的势头，全国各地布病检测阳性率和患病率逐年上升[11]。宁夏布病疫情与全国一致，也保持着上升的势头，2004-2010年的调查数据显示，报告发病率从0.017/10万上升到3.141/10万，职业以农民居多，占69.94%，疫区范围不断扩大，地区分布不均衡，患者以男性青壮年为主[12]。2018年布病发病率达24/10万以上，说明宁夏的布病疫情一直处于高发攀升水平。宁夏20世纪就开展了病原学监测工作，自1958年宁夏首次在军马场确诊病人体内分离到羊种布鲁氏菌后，至1989年该区共分离到布鲁氏菌138株，包括4个种12个生物型，其中引起人体感染的主要种型为羊种布鲁氏菌[13]。2009年宁夏开展布病病原学监测以来，主要菌型为羊种3型布鲁氏菌，说明近期分离布鲁氏菌种型与以往感染人体主要菌型一致。

近年来，不同的分子分型方法用于布鲁氏菌分型，常用的有聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)[14]、AMOS-PCR[15]、单核苷酸多态性研究(SNP)[16]、多位点序列分型(MLST)技术等[17]。MLVA技术用于布鲁氏菌基因分型操作简单，分辨力高和可重复性较高，实验结果易于分析，可以追溯传染源，确定流行趋势。目前该方法已广泛应用于结核分枝杆菌[18]、炭疽芽孢杆菌[19]、大肠埃希菌O157:H7[20]以及肠炎沙门菌[21]等一些细菌的分型分析。本研究采用Le Fleche P建立的布鲁氏菌MLVA-16分型引物，对宁夏近期分离布鲁氏菌和历史菌株共68株进行分析，结果表明，按相似度80%划分，68株菌可被分为8大基因群、39个基因型，表明宁夏目前流行的布鲁氏菌存在丰富的基因多态性。从地理位置分析，宁夏与内蒙古、甘肃、陕西等省区接壤，周边省区畜牧业发达，是宁夏的畜牧流动集散地，同时由于畜牧业的发展引进养殖动物，加之本土布鲁氏菌病的流行，当地分离到的菌株显示出丰富的基因多态性。根据实验结果，结合病人发病时间、菌株分离时间、分离地区等流行病调查资料推断，极有可能是同一传染源造成不同接触者的感染发病，具体到同一个基因型的其他菌株，还需要开展流行病学调查来更进一步做系统分析。

根据以上研究结果，通过 MLVA 分析可以及时掌握传染源的流动，尽早控制、扑灭传染源，为布病的防制提供有力的分子生物学依据，对布病传染源追踪、暴发流行调查等具有非常重要的意义。