实验鱼生物饵料的质量控制

李建军蔡 磊余露军黄 韧

(广东省实验动物监测所,广东省实验动物重点实验室,广州 510663)

实验动物饲料质量是与实验动物质量密切相关的重要条件,也是保证动物实验顺利进行和实验结果准确可靠的基础。实验鱼个体小,口径小,其微粒饲料应满足下列基本条件：1)符合实验鱼摄食习性、生理机能及不同生长时期的营养需求;2)水中稳定、悬浮、不结团,粒径合适;3)诱食,易被发现和捕食;4)适口,易消化吸收[1]。近年来国内外微粒饲料的配方和制备工艺技术虽取得一定进步,但仍无法达到生物饵料饲喂的生长率和存活率[2]。生物饵料指经过人工筛选的、可进行人工培养且适合养殖对象采食的生物,其具有适口、营养丰富、增殖快、增强抗病能力、对水质污染小等特点[3],被公认为是当今及今后较长时间内实验鱼的主要饲料。

1 生物学特性

目前实验鱼的主要生物饵料有：大草履虫(Paramecium caudatum)、褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)和卤虫(Artemia salina)等。

草履虫是浮游动物的重要组成部分,具有分布广、个体大、易培养、繁殖快等特点[4],是斑马鱼等许多水生经济动物幼体的开口饵料。目前世界上已报导草履虫22种,我国草履虫常见种为大草履虫(又称尾草履虫),隶属于纤毛纲(Ciliata)、膜口目(Hvmenostomatida)、咽膜亚目(Peniculina)、草履虫科(Parameciidae)、草履虫属(Paramecium)。大草履虫长180～280μm,繁殖适温10℃～30℃,生长最适温度25℃;适宜pH值5.0～10.0,中性略偏酸环境生长较好,常在有机质较多的死水或缓流中生活[5-6]。

轮虫属轮虫动物门(Rotifera)、轮虫纲(Rotifera)、真轮亚纲(Eurotatoria),其大小适宜、营养丰富、适应性强、繁殖快、易大量培养,是一种重要的水生动物饵料[7]。其中使用最广泛的皱褶臂尾轮虫,大小在150～360μm之间,分为 L型和S型[8]。

卤虫属节肢动物门(Phylum Arthropoda)、有鳃亚门(Subphylum Branchiata)、甲壳纲(Class Crustacea)、鳃足亚纲(Subclass Branchioplda)、无甲目(Order Anostraca)、盐水丰年虫科(Family Branchinectidae)、卤虫属(Artemia)[9]。无节幼体长500～700μm、宽180～250μm,不同品系大小略有差异;世界各大陆的盐湖、盐田等高盐水域中均有分布,传播的主要媒介为风和水鸟;幼虫适盐范围为20～100,成虫为 10～25;耐温范围 6℃ ～35℃,生长最适温度25℃～30℃;可耐1 mg/L低氧,也能生活于1～1.5倍饱和氧环境;孵化用水pH值8～9为宜,低于8孵化率降低;主要滤食50μm以下的颗粒,5～16μm的颗粒摄食率较高,天然环境中以细菌、微藻和有机碎屑等为食。

2 营养成分

2.1 主要营养成分含量

草履虫营吞噬营养,细胞质中含有蛋白质、多糖和脂类等物质,含水率75%～85%。

褶皱臂尾轮虫体内蛋白质含量占干重28%～63%,脂类占9%～28%,面包酵母培养的轮虫,其总脂类含量较低,延长藻类或经脂类强化的酵母的投喂时间可提高轮虫脂类含量[10]。

脱壳后卤虫卵、初孵无节幼体和养殖成虫的总蛋白质含量分别为43%～57%、54.6%～59.9%和55.6%～58.2%[11];卤虫卵总脂肪含量为17.98%,去壳卵粗脂肪含量16.64%,初孵无节幼体脂肪占干重的20.84～23.53%。卤虫卵及其初孵无节幼体含较多的棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚麻酸、亚油酸。成虫除含有大量的不饱和脂肪酸外,还含较多维生素、胡萝卜素、抗坏血酸。卤虫休眠卵内甘油和海藻糖分别占干卵重的5%和15%～17%[12]。

2.2 营养成分影响因素

草履虫培养液的制备方法有多种,主要包括：稻草培养法、玉米培养液法、酵母片培养液法、沼液培养液法、麦粒培养液法及其他培养液法,另外,西瓜皮、香蕉皮、香瓜皮、桃子皮等材料以及池沼的禾本科植物或当年的禾本科农作物均可培养出草履虫[13]。玉米穗、玉米粒培养液因营养丰富,能产生大量细菌,利于草履虫繁殖,培养效果较好。而荷叶、槐叶营养成分低,新鲜荷叶、槐叶在晾干过程中可能产生不利于细菌生长的物质,培育效果欠佳。

天然环境中的轮虫和卤虫营养价值全面。酵母培养的轮虫大多缺乏N-3系列高度不饱和脂肪酸,特别是EPA和DHA,而海洋微藻中EPA、DHA含量较高,因此可选用N-3系列不饱和脂肪酸含量丰富的藻种如三角褐指藻、新月菱形藻、纤细角毛藻、球等鞭金藻、小球藻、微绿球藻等对酵母轮虫进行营养强化[14]。

卤虫的营养成分与其品系、发育阶段、生存环境(特别是饵料条件)等因素有关[11]。卤虫生长发育时,其体内的蛋白质含量逐渐增加,且随所摄取的饵料等因素的变化而变化。不同品系卤虫蛋白质含量不同。脂肪酸的组成及含量是影响卤虫营养价值的主要指标[15]。不同品系卤虫脂肪酸含量不同,18 ∶3ω3、18 ∶4ω4、20 ∶5ω5 含量尤其差别大[16]。卤虫卵孵化是体内营养物质不断消耗的过程,其脂肪酸含量逐渐减少,特别是卵磷脂。即使是同一品系的卤虫卵,孵化条件不同,无节幼体含有的能量也不同。低盐高温孵化,卤虫初孵无节幼体含有的能量较多[12]。

3 有毒有害物质

Mansouri-Aliabadi等[17]研究表明,重金属(锌、镍和铅)可通过食物传递到草履虫;陈伟琪等[18]研究也显示,藻类、轮虫等海洋生物都能直接从海水中吸收铜,铜可沿着海水→扁藻→轮虫→仔虾进行传递;大连湾海域浮游生物体内Pb和Cd含量超过生物污染评价标准[19]。钦州湾东部海域浮游生物Cd、Hg含量达 1.51×10-1mg/kg干重、9.48×10-3mg/kg干重,远高于水体含量,呈现出重金属从水体到浮游生物的迁移转化规律,浮游生物对重金属的富集系数最高达40 000,表明浮游生物对重金属有很强的富集能力[20]。因此,野生环境下的生物饵料(如草履虫、轮虫、卤虫)可富集水环境中的重金属等多种有毒有害物质,在使用生物饵料时应对其有毒有害物质含量进行检测评价。

由于各种来源的生物饵料质量良莠不齐,目前已有相关标准对生物饵料有毒有害物质进行规定,如DB13/T 787-2006《褶皱臂尾轮虫土池养殖技术规范》[21]和 DB13/T 789-2006《卤虫养殖技术规范》[22]要求作为生物饵料的轮虫和卤虫有毒有害物质含量应严格低于NY 5073《无公害食品 水产品中有毒有害物质限量》[23]的规定。实践表明,实验室培育的草履虫、轮虫和质量较好的卤虫,其有毒有害物质含量可符合NY 5073《无公害食品水产品中有毒有害物质限量》[23]的要求(表1),风险可控。

4 携带病原

国内外已有较多关于生物饵料可能携带致病微生物的报道,如卤虫卵和轮虫休眠卵可通过PCR方法检测到WSSV阳性[24-25];宋晓玲等[26]研究也显示桡足类、卤虫等可检出WSSV;何建国等[27]通过人工感染和PCR方法证明桡足类是WSSV的宿主,而且进一步证明桡足类是WSSV等病毒传播的媒介生物之一。同时,生物饵料也是弧菌的重要携带者,Thompson等[28]、Gomezgil等[29]从海水轮虫中分离到多种弧菌;吴岗等[30]从市售卤虫分离到3种优势弧菌;Bergh等[31]、Alvise等[32]研究表明卤虫和轮虫可传播水产上危害极大的鳗弧菌。鉴于生物饵料存在携带病原微生物风险,许多学者提出了加强卤虫卵等生物检验检疫的方法和策略,但尚无专门的病原检疫程序[33]。

国内外已有学者成功培育无菌轮虫和无菌卤虫[34-35],但生产上更多的是采用臭氧、消毒剂等方法消毒或益生菌定植培养等方法对轮虫、卤虫等生物饵料的致病微生物进行控制,并取得了非常理想的效果[36-37]。从上述研究结果可知,使用生物饵料时应对其病原微生物进行检测和评价,经严格消毒控制或净化培育的草履虫、轮虫、卤虫等生物饵料携带病原风险可控。

5 推荐生物饵料质控要求

5.1 草履虫培育

5.1.1 草履虫引种时的纯化

将含有草履虫的液体吸入表面皿(或凹玻片)中,在显微镜或解剖镜下检查,用直径约0.2 mm的微吸管将表面皿(或凹玻片)中的草履虫逐个吸出(必要时用超纯水或去离子水反复稀释、冲洗)培养。

表1 实验室培育褶皱臂尾轮虫和卤虫有毒有害物质检测结果(mg/kg)Table 1 Detection results of toxic and harmful substances in Brachionus plicatilis and Artemia salina cultured in laboratory

5.1.2 草履虫的培养

将纯培养的草履虫倒入至500 mL或1000 mL烧杯中,加适量除氯的自来水,每天滴加1～2滴新鲜配制浓度为0.9～3.0 g/L的酵母原液,在水温22℃～28℃、pH值6.5～7.5的条件下培养。培养过程尽量保持环境因子恒定。

5.1.3 草履虫的收集投喂

当培养液中草履虫密度较大时,收集培养液表面的草履虫,用仔鱼养殖水冲洗(必要时用300～500目筛绢过滤),稀释至每毫升100～150个的密度投喂。

5.2 褶皱臂尾轮虫培育

5.2.1 褶皱臂尾轮虫的纯化

将含有褶皱臂尾轮虫的液体吸入表面皿(或凹玻片)中,在显微镜或解剖镜下检查,用直径约0.5 mm的微吸管将表面皿(或凹玻片)中的褶皱臂尾轮虫逐个吸出(必要时用灭菌海水反复稀释、冲洗)培养。

5.2.2 褶皱臂尾轮虫的培养

培养用水需经砂滤、300目的筛绢网过滤或其他方式处理以除去小型甲壳动物等敌害生物。盐度15～25,pH 值 7.5～8.5,温度 25℃ ～30℃,溶氧2.0 mg/L以上,非离子氨1.0 mg/L以下,光照强度500 lx左右,可连续照明,也可间隔照明(如光暗周期为18∶6),或自然光照。

接种褶皱臂尾轮虫的密度每毫升不宜小于0.1个。宜采用海水小球藻培养,藻类密度约保持为每毫升2.0×106个细胞。如以酵母培养,投喂鱼苗前应采用海水小球藻进行营养强化24 h以上。连续充气,充气量不宜过大。经常检查轮虫的生长情况,轮虫死壳多,身体上附着污物,沉底、不活泼、不带卵或带冬卵为不良情况,应改进培养方法。

5.2.3 褶皱臂尾轮虫的投喂

投喂前经60目筛绢网过滤除去藻渣等杂质,300目筛绢网收集轮虫。

5.3 卤虫孵化与投喂

5.3.1 卤虫卵的质量要求

可购买商品卵。卤虫卵孵化率≥80%,含水率≤8.0%,杂质≤1.0%。检验按SN/T 0476的规定执行。运输过程中应防止包装破损、日晒、雨淋。卤虫卵应在低温(-20℃～4℃)、干燥、避光、密封环境下贮存。严禁与有毒、有害物品混合存放。开罐后卤虫卵应尽快使用。

5.3.2 卤虫卵的孵化

孵化前用2%～3%的福尔马林浸泡10～15 min,或次氯酸钠(有效氯达20 mg/L)溶液浸泡30 min,然后用清水冲洗,也可采取其他消毒方法。孵化密度不宜超过每升3.0 g干重。水温25℃～30℃、盐度10～30、pH7.5～8.2,光照 1000 ～3000 lx,溶解氧大于5.0 mg/L。连续充气,充气量以能把容器底部的虫卵充分吹起并使卵均匀分布为宜。

5.3.3 卤虫的投喂

投喂前去除空壳和未孵化的卤虫卵,用150目筛绢网袋收集、冲洗卤虫无节幼体。幼体孵出后24 h内投喂。也可投喂经清洗的脱壳卤虫卵。

6 小结

综上所述,大草履虫、褶皱臂尾轮虫、卤虫等浮游生物大小适宜,营养丰富,增殖迅速,便于实验室培养,对水质污染小,按质量控制要求培养携带病原和有毒有害物质风险可控,是实验鱼的优良饵料。