降压物质检查试验中家猫对组胺灵敏度分析

黄甘泉吴贤生王凤姬姚嘉琪黄 锐梁冠泽严家荣邝少松

(广东省医学实验动物中心,佛山 528248)

猫在生理及医药学上的研究使用,最早可追溯到19世纪末[1]。猫的循环系统发达,血压稳定,对强心苷和组胺较敏感,并且可以迅速代谢组胺等生物,适用于药物筛选与降压物质检查试验[2]。因此在中国药典、欧洲药典和英国药典收录的降压物质检查法中,猫都是方法指定的实验动物。受困于国内猫的实验动物化进展缓慢,我们很难通过市场购买途径获得具有实验动物质量合格证明的实验猫。目前用于药品检测的实验用猫仍以农户饲养家猫、宠物猫和流浪猫为主。这些猫遗传背景、年龄、健康状态、携带病原生物不明,体重差异较大,均可能影响到实验结果的准确性。

刘明慧等[3]推测中国每年用于实验的猫的数量达5000只,但其背景数据等少见报道。本研究中,本研究统计了近年来本单位用于降压物质检查的404只实验用猫的血压值和其对组胺的灵敏度,为今后降压物质检查试验或其他以猫作为实验系统的心血管方面试验提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

成年雄性家猫404只,体重2.5～4.5 kg,均购于广东省广州市周边农村。动物实验在广东省医学实验动物中心[SYXK(粤)2018-0002]开展。实验动物伦理由广东省医学实验动物中心伦理委员会审批,伦理审批号：A201501-3、A201601-18、A201701-17、A201801-24、A201901-13。 本实验涉及的与动物实验相关的内容和程序遵从实验动物使用和管理的相关法律法规及本机构实验动物伦理委员会的相关规定,遵循动物使用的“3R”原则,给予动物人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

BL-420S生物机能仪,成都泰盟科技有限公司;电子天平,上海蒲春计量仪器有限公司;磷酸组胺标准品,中国食品药品检定研究院;肝素钠注射液,成都市海通药业有限公司;盐酸赛拉嗪注射液,吉林省敦化市圣达动物药品有限公司;戊巴比妥钠,美国Sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物麻醉

通过肌肉注射盐酸塞拉嗪注射液0.1 mL/kg和耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠溶液10 mg/kg体重联合麻醉[4],需要用于2批次及2批次以上样品降压物质检查的家猫,在完成第一轮降压物质检查试验后(约1 h),皮下注射戊巴比妥钠进行补充麻醉,补充麻醉剂量为3 mg/kg体重。

1.3.2 血压测量

家猫麻醉后分离一侧颈动脉并连接生物机能仪进行血压测定,分离一侧股静脉用于组胺对照品和样品的注射。按照《中国药典》降压物质检查法的要求,每批次样品检查前按家猫体重每1 kg注射组胺0.05 μg、0.10 μg、0.15 μg,重复 2次,取 2次同剂量组胺引起的血压反应的均值作为该使用次数的反应值。相邻2次注射的间隔时间尽量保持一致,每2次灵敏度检查的重复时间间隔为 50～55 min。

1.3.3 数据整理和分析

比较和分析家猫体重对基础血压值和首次使用组胺灵敏度的影响,基础血压值对组胺灵敏度的影响。比较不同使用次数家猫的血压值和灵敏度,分析重复使用次数对家猫血压值和组胺灵敏度的影响。

1.4 统计学方法

应用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析,数据以平均数±标准差(±s)表示。组间比较采用单因素方差分析,方差不齐时采用非参数检验进行分析,P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 家猫体重与血压基础值

本研究共统计了404只雄性家猫麻醉状态下的颈动脉基础血压值,这些家猫平均体重为3.41 kg,平均颈动脉收缩压、舒张压和平均压分别为：(18.10±3.69)kPa、(13.32±2.88)kPa和(14.91±3.10)kPa。将家猫按照体重大小划分,分别统计其体重和基础血压值的关系,其结果如表1所示,不同体重的家猫血压均未见明显差异(P＞ 0.05)。

2.2 家猫体重和对组胺的灵敏度

本研究所统计的404只家猫对0.05μg/kg、0.10μg/kg和0.15μg/kg组胺所致血压反应值分别为(3.25±1.11)kPa、(4.72±1.31)kPa和(5.38±1.45)kPa。如表2所示,不同体重的家猫对3个剂量的组胺灵敏度均未见明显差异(P＞0.05)。

2.3 基础血压值对灵敏度和使用次数的影响

如图1所示,0.05μg/kg、0.10μg/kg和 0.15 μg/kg剂量的组胺所致家猫血压反应值和家猫的基础血压值均成正相关(P＜0.05)。相同剂量的组胺,在基础血压值较高的家猫身上会引起更大的降压作用,可认为基础血压值高的家猫对组胺引起的血压降低作用更为敏感。

如表3所示,将家猫基础血压值按2 kPa幅度划分区间,家猫对组胺所致的血压反应值随基础血压升高而增大。家猫基础血压值低于12 kPa时,平均用于检测药品降压物质的次数为4.11次。14～16 kPa基础血压值范围的家猫可重复使用次数最高,达到5.04次,显著高于＜12 kPa范围的家猫(P＜0.05)。基础血压值高于16 kPa后,家猫的可重复使用次数减少。

2.4 重复使用次数对家猫血压值和灵敏度的影响

如表4所示,家猫重复用于降压物质检查,前6次使用时的基础血压值未见明显下降。与首次使用血压基础值比较,重复使用第7次和第8次时家猫血压基础值显著下降(P＜0.05)。

前6次使用时,随着使用次数增加,低剂量组胺引起家猫的血压反应值逐渐减小,中剂量所致反应值未见明显波动,高剂量所致反应值升高。与初次使用比较,第4～6次低剂量组胺所致反应值明显降低(P＜0.05),第3次和第4次高剂量所致反应值明显升高(P＜0.05)。

表1 家猫体重对基础血压值的影响(♂)Table 1 Influence of body weight on blood pressure of domestic cats

表2 家猫体重对组胺灵敏度比较(♂)Table 2 Influence of body weight on sensitivity for histamine of domestic cats

图1 家猫血压值与不同剂量组胺灵敏度相关性分析Figure 1 Correlation analysis of sensitivities for different dosage of histamine and blood pressure of domestic cats

与首次使用比较,第7次重复使用时家猫基础血压值和低剂量组胺所致反应值均显著下降(P＜0.05),中剂量和高剂量所致反应值小幅下降(P＞0.05)。第8次重复使用时,家猫基础血压值和低、中、高剂量组胺所致血压反应值均显著下降(P＜0.05)。

3 讨论

药品在生产制造过程中,可能会混入使血管扩张而降低血压的活性物质(包括组胺、缓激肽等组胺类物质),中药中也含有大量降低血压的未知和已知杂质成分。静脉注射该类药品有急性降血压作用,有可能诱发严重的心血管系统不良反应[5]。目前《中国人民共和国药典》2015年版收录的检测引起血压下降物质的方法主要降压物质检查法和组胺类物质检查法,有研究报道,组胺类物质检查结果不可直接外推至整体实验[6-7]。因此降压物质检查法仍是当前最主要的检测药物制剂降压物质的检测方法。

根据《中国人民共和国药典》2015年版规定,降压物质检查使用家猫进行,雌雄均可,雌性动物应无孕[8]。因无法购买到质量可靠的标准化实验猫,在开展降压物质检查活动时我们仅能从广州附近收购农户的家猫,并且仅能在麻醉后才能够仔细检查家猫是否无孕,出于动物伦理和保证实验质量的考虑,我们仅选择使用雄性家猫进行实。

在进行麻醉时,盐酸塞拉嗪作为肌松剂,主要作用是使家猫肌肉松弛,以便静注戊巴比妥钠,联合麻醉可以降低戊巴比妥钠的使用剂量,减少麻醉风险,达到良好的麻醉效果[9]。联合麻醉的维持时间约为2 h,同一只猫如需进行多批受试样品的降压物质检查,在完成第一批受试样品降压物质检查后皮下注射戊巴比妥钠溶液补充麻醉[10]。与肌注或者静注给药方式补充麻醉相比,皮下注射补充麻醉的方式因吸收缓慢,可以避免快速补充麻醉剂而导致猫血压的下降,从而减少补充麻醉对检测结果的影响。同时应密切关注猫的麻醉状态,不同的麻醉深度对血压有影响,本研究中通过观察麻醉家猫呼吸,黏膜颜色和基础血压值等适当补充麻醉,尽可能使得家猫处于麻醉三期(外科麻醉期)以减少不同麻醉深度对血压的影响。例如麻醉家猫出现呼吸不规则、基础血压升高、挣扎等症状,说明麻醉过浅,应该补充麻醉;例如呼吸减慢,出现呼吸抑制或基础血压下降等症状,说明麻醉过深,应注射麻醉解药(肾上腺素)[11]。

表3 血压对家猫组胺灵敏度和重复使用次数的影响(♂)Table 3 Influence of blood pressure on sensitivity for histamine and reuse capability of domestic cats

表4 重复使用次数对家猫灵敏度影响(♂)Table 4 Influence of reuse time on sensitivity for histamin of domestic cats

本研究中我们共统计了2015～2019年间我单位使用的猫家的血压数据,在尚无标准化实验猫可供使用的情况下,这些数据应有较大参考意义。通过比较不同体重范围家猫的血压基础值和其对组胺的灵敏度,寻找适合实验的家猫体重范围。实验结果表明,虽然家猫的体重差异较大,但基础血压值和对组胺的灵敏度均很稳定,不受体重的影响。麻醉后的基础血压值对家猫的可重复使用次数较为相关,基础血压值在16～18 kPa范围的家猫可重复使用次数最多。影响家猫的基础血压值的因素包括遗传背景、个体差异、健康状态、麻醉剂选择与麻醉深度等。在进行降压物质检查试验时,选择健康状态良好的实验动物和适合的麻醉方法,可增加每只家猫用于样品检测的次数,从而减少家猫的使用。

《中国药典》对降压物质检查中家猫对组胺灵敏度的要求是中剂量组胺(0.01μg/kg)所致反应值不低于2.67 kPa,同时各剂量所致反应值有差别。本次研究中,家猫每次重复使用间隔均为1 h左右,在前6次重复使用过程中,家猫的血压值和对中剂量组胺的灵敏度均未见明显变化,并且重复使用后家猫对不同剂量的组胺所致反应值差别增大,其增大的原因仍未清楚。第7、8次重复使用时,血压值出现较明显降低,对组胺的灵敏度也逐渐减小,但仍满足《中国药典》对灵敏度的要求。因为实验时间以及工作安排方面的原因,我们未进行更多重复使用次数的实验。

目前国内用于降压物质检查的家猫多为非标准化实验动物,其个体差异不可控制,健康状况无法保证,同时因这些家猫常常携带寄生虫和微生物,对实验结果以及实验人员的安全均产生威胁和影响[12-13]。虽偶有标准化实验猫建立的文献报道,却未见推广和销售[3]。以此,建立实验猫的繁殖、培育和检验相关标准以及标准化实验动物仍需持续推进。