引起儿童呼吸道感染的优势肠道病毒及其血清型和流行特征分析

汪 敏，杨爱平，陈 燕，胡萍芳，严 杰

肠道病毒(enterovirus，EVs)为小RNA病毒科肠道病毒属单正链RNA病毒，主要有脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、埃可病毒(Echovirus)和新型肠道病毒EV68～EV71[1]。EVs通过肠道感染，但往往引起肠外疾病，如支气管炎和肺炎、手足口病、心肌炎、心包炎和脊髓灰质炎等，但以儿童呼吸道感染最为常见[1-2]。此外，EVs血清型众多，不同血清型地域分布及其所致疾病有明显差异[3-6]。众所周知，包括我国在内的不少国家和地区流行EV71和一些柯萨奇病毒血清型感染所致的手足口病，但近年来EVs引起的儿童呼吸道感染性疾病发病率不断升高，引起国内外广泛关注[7-11]。所有EVs具有衣壳蛋白VP1，但不同EVs及其血清型VP1序列可有明显差异，故VP1基因不仅用于EVs分类参考，也作为血清型分类依据[12]。本研究中，我们采用VP1基因通用引物的实时荧光定量RT-PCR检测了2 164例呼吸道感染患儿标本中EVs，阳性标本采用EVs VP1/VP3基因通用引物的套式RT-PCR扩增后测序分型，以了解本地区儿童呼吸道感染性疾病的优势EVs及其主要血清型和流行特征，为此类疾病临床诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1一般临床资料 采集2016年1月至2018年12月杭州地区多家门诊或住院2 164 例发热伴急性呼吸道感染症状患儿咽拭子标本，其中男性患儿1 297例、女性867 例，患儿最大年龄13 岁、最小34 d，中间年龄3岁。

1.2主要仪器与试剂 RNA病毒核酸提取试剂盒(湘长械备20150021)和EVs核酸检测试剂盒(国械注准20173400073)购自湖南圣湘生物科技有限公司。实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司产的ABI-7500型。电泳仪和凝胶图像分析系统为美国Bio-Rad公司产品。

1.3 方 法

1.3.1病毒RNA提取 按照病毒核酸提取试剂盒的说明书，采集咽拭子置于标本保存液中，充分震荡混合后取200 μL移入1.5 mL灭菌试管中，加入600 μL提取液-1震荡混匀，瞬时离心后加入100 μL提取液-2震荡混匀，室温静置30 min，瞬时离心后将试管置于分离器上，静置3 min后吸弃分离液，加入600 μL提取液-3和200 μL提取溶液-4震荡混匀，瞬时离心后将试管置于分离器上，静置3 min后吸弃分离液，加入30 μL RNA洗脱液，混匀后室温静置5 min，将离心管置于分离器上静置3 min，吸取洗脱液即为病毒RNA提取物，置—70 ℃备用。

1.3.2实时荧光定量RT-PCR 按照EVs核酸检测试剂盒说明书，每管加入实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)反应液43 μL、酶混合液2 μL、病毒RNA模板5 μL，然后在实时荧光定量PCR仪上检测。反应条件：95 ℃ 1 min、50 ℃ 30 min逆转录；95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s, 共45个循环进行扩增。

1.3.3EVs分型 参照文献[13]合成EVs VP1/VP3区通用分型测序引物(表1)。qRT-PCR检测EVs核酸阳性标本进行套式PCR(Nested-PCR)扩增。采用通用引物224/222进行逆转录和第1 次PCR扩增，反应参数：95 ℃ 1 min、50 ℃ 30 min逆转录；95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共45 个循环进行扩增。以5 μL第1 次PCR产物为模板，采用通用引物AN89/AN88进行第2次PCR扩增，反应参数：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共 30 个循环进行扩增。用溴乙锭预染色1.5%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物，委托泰和永昌(长沙)生物技术有限公司采用双脱氧末端终止法测序。测序结果在GenBank数据库中的序列进行Blast比对，获得EVs种类及其分型结果。

表1 EVs套式PCR扩增引物Tab.1 Primers for amplification of EVs by nested PCR

1.3.3EVs基因种系发生分析 参照文献选择GenBank中代表性参考序列[13]，上述EVs VP1/VP3区测序并EVs种类及其分型结果的每条序列采用ClustalW-2.1软件默认参数进行多序列比对，采用Mega 6.0软件和Neighbar-Joining法构建种系发生进化树并分析。

1.3.4不同年龄和性别儿童易感性分析 qRT-PCR检测EVs核酸阳性以及套式PCR和测序后病毒分型的患儿进行不同性别和年龄对EVs及其主要血清型易感性分析，其中不同患儿年龄分为<1、1～、2～、3～、4～和≥5 岁共6 组。

1.3.5统计学分析 采用SPSS 19.0软件中χ2检验对不同EVs及其血清型检测阳性率、不同年龄与性别患儿对EVs及其血清型感染率进行比较与分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1EVs检测阳性率与分型结果 2 164例发热伴急性呼吸道感染症状患儿咽拭子标本中，23.5%(508/2 164)的标本EVs RNA检测结果阳性。508 例EVs RNA阳性标本中，57.1%(290/508)成功扩增后分型(图1和表2)，其余218 例(42.9%)因病毒RNA浓度太低未能扩增分型。290例EVs分型的标本中，柯萨奇病毒A组(CoxA)和B组(CoxB)分别有218 例(75.2%)和34例(11.7%)、EV71有26 例(8.9%)、埃可病毒(Echo)有12 例(4.1%)，柯萨奇病毒(86.9%，252/290)是引起儿童呼吸道感染的优势EVs种类(χ2=330.70，P<0.05)，尤其是CoxA检出率高于CoxB、EV71和埃可病毒(χ2=243.22、260.80、305.75，P<0.05)。218 例CoxA阳性标本中，CoxA6(39.5%，86/218)和CoxA10(33.0%，72/218)检出率高于CoxA16(14.7%，32/218)、CoxA4(8.3%，18/218)和CoxA2(4.6%，10/218)(χ2=33.88、20.20，P<0.05)。

注：泳道M为DNA marker，泳道1和5为空白对照，泳道2～4为3例标本的VP1-VP3基因大扩增片段(～975 bp)，泳道6～8为3例标本的VP1基因小扩增片段(～350 bp)图1 通用引物和套式PCR扩增的EVs基因片段Fig.1 Fragments of enteroviral genes amplified by Nested-PCR using universal primers

表2 290例呼吸道感染患儿的EVs分型结果Tab.2 Typing of the enteroviruses from 290 children with respiratory infection

2.2检出的EVs血清型进化树分析结果 与GenBank中相应代表性参考序列比较[13]，CoxA2、CoxA4、CoxA6、CoxA10、CoxA16、CoxB1、CoxB5、Ech11和Echo30序列同源性较高，为90.1%～99.8%；EV71序列有一定差异，同源性为85.7%～99.7%；提示所采用的VP1/VP3基因测序分型法能有效鉴定EVs阳性标本中的病毒型别(图2)。

注：*表示来自GenBank的参考序列图2 检出的EVs系统进化树Fig.2 Phyletic evolution tree of detected enteroviruses

2.3不同EVs所致疾病种类 柯萨奇病毒和埃可病毒通常引起各种肠外感染，EV71主要引起手足口病、疱疹性咽峡炎以及少数儿童脑炎、脑膜炎，但也可引起呼吸道感染，脊髓灰质炎病毒主要引起脊髓灰质炎[1,14-17]。290例经EVs分型的发热伴急性呼吸道症状患儿中，205例诊断为鼻咽喉、扁桃体和口腔等上呼吸道感染，27例为下呼吸道感染性疾病，58例为伴有呼吸道症状的手足口病、脑炎和膜脑炎、高热惊厥，详见表3。232例确诊的呼吸道感染疾病患儿中，可检出柯萨奇病毒、埃可病毒和EV71，但CoxA占77.2%(179/232)(χ2=68.4，P<0.05)，其中CoxA6(30.6%，71/232)和CoxA10(25.9%，60/232)为优势柯萨奇病毒血清型(χ2=54.1、34.9，P<0.05)。

2.4不同性别儿童对EVs及其血清型易感性 508例qRT-PCR检出EVs感染的发热伴急性呼吸道感染症状患儿中，63.0%(320/508)为男童，37.0%(188/508)为女童，男童较女童易感(χ2=68.60，P<0.05)。在感染主要的EVs(CoxA6、CoxA10、CoxA16和EV71)患儿中，男童较女童易感CoxA6(χ2=11.25，P<0.05)、女性较男性儿童易感CoxA10(χ2=4.00，P<0.05)，但不同性别儿童对CoxA16和EV71感染率差异无统计学意义(χ2=1.00、2.77，P均>0.05)(表4)。

表3 不同EVs感染所致疾病种类Tab.3 Disease types caused by infection with different enteroviruses

表4 不同性别患儿对不同EVs及其血清型易感性Tab.4 Susceptibility of different sex children to enteroviruses and their serotypes

2.5不同年龄儿童对EVs及其血清型易感性 508例qRT-PCR检出EVs感染的发热伴急性呼吸道感染症状患儿中，1 岁儿童最易感(χ2=13.15，P<0.05)，其次是2 岁儿童(χ2=9.20，P<0.05)和3 岁儿童(χ2=4.96，P<0.05)，<1岁、4岁和≥5岁儿童感染率差异无统计学意义(P>0.05)(表5)。在感染主要EVs(CoxA6、CoxA10、CoxA16和EV71)的患儿中，1 岁和2 岁儿童对CoxA6和CoxA10易感(χ2=5.79、7.15、9.25，P<0.05)，但不同年龄儿童对CoxA16和EV71的感染率差异无统计学意义(χ2=2.74、2.36，P均>0.05)(表5)。

表5 不同年龄患儿对EVs及其血清型易感性Fig.5 Susceptibility of different age children to enteroviruses and their serotypes

3 讨 论

近年来，EVs引起的呼吸道感染性疾病发病率逐年升高，尤其是儿童夏季呼吸道感染，EVs是主要病原体之一[2,9-10]。此外，不同国家或地区引起呼吸道感染的优势EVs种类及其血清型差异较大。例如，2008年中国台北地区CoxA2引起的儿童急性呼吸道感染暴发流行[18]；2012年泰国发生CoxA8引起的儿童急性呼吸道感染大规模暴发流行[4]；2014年巴西暴发了CoxA9为主的儿童急性呼吸道感染[19]；2010年芬兰和2014—2015年美国暴发了EV68引起的严重儿童呼吸道感染[20-21]。然而，近年来仅北京、上海、深圳和本省湖州地区开展了儿童呼吸道感染性疾病中优势EVs及其血清型的流行病学研究[11,22-25]，但国内其他地区无相关研究报道。

引起呼吸道感染的病原微生物种类繁多，一些细菌(包括支原体和衣原体)、病毒和真菌均可成为人呼吸道感染的病原体。引起儿童呼吸道感染的病毒除EVs外，还有流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、冠状病毒和腺病毒等[1]。本次2 164例发热伴急性呼吸道感染症状患儿咽拭子标本中，有23.5%(508/2 164)的标本EVs RNA检测结果阳性，提示EVs可能是当前儿童呼吸道感染的重要病原体，值得引起重视。

EVs种类及其血清型众多，除脊髓灰质炎病毒有3 个血清型外，柯萨奇病毒分A组和B组(CoxA和CoxB)，CoxA有23 个血清型、CoxB有6 个血清型，埃可病毒有31 个血清型，其中柯萨奇病毒和埃可病毒所致疾病谱广泛，可引起心肌、神经、呼吸、消化系统和全身感染，EV68～71中目前仅肯定EV68和EV71可引起呼吸道感染[1,14-16]。尽管在136 例明确诊断为呼吸道感染的患儿咽拭子标本中检出了柯萨奇病毒、埃可病毒和EV71，但CoxA占77.9%(106/136)(P<0.05)，在检出的5 个CoxA血清型中，CoxA6(23.5%)和CoxA10(22.1%)为优势血清型(P<0.05)。国内文献报道，深圳地区引起儿童呼吸道感染的优势EVs主要是CoxA6、其次是CoxA16；邻近的上海市主要是CoxA2、CoxA5和CoxB5；上海市松江地区主要是CoxB3、其次是CoxA4；本省湖州地区主要是CoxA6、其次是CoxA2[11,22-25]。上述资料表明，引起儿童呼吸道感染的主要EVs为CoxA，但不同地区优势CoxA血清型存在很大差异。

了解病原微生物流行特征及其易感人群，对于相关疾病的有效防控具有重要意义。我们的实验结果显示，508 例EVs检测阳性发热伴呼吸道症状患儿中，男童较女童易感(P<0.05)，主要感染的病原体CoxA6、CoxA10、CoxA16和EV71中，男童易感CoxA6、女童易感CoxA10(P<0.05)，1 岁儿童最易感、其次是2和3岁儿童(P<0.05)，<1 岁儿童易感性较低可能与来自母体过继免疫力、≥4 岁儿童自身免疫系统开始发育成熟有关[26]。然而，我们的检测与分析结果显示，不同性别和年龄儿童对CoxA16和EV71感染率差异无统计学意义(P>0.05)。国内文献报道，深圳地区EVs呼吸道感染儿童易感年龄为2 岁以下；上海市松江地区和本省湖州地区易感年龄分别为6 个月～6 岁和3岁以下；北京地区和上海市资料中未分析易感年龄[11,24-25]。综上所述，由于不同国家或同一国家不同地区引起呼吸道感染的优势EVs种类及其血清型差异较大，了解本地区引起呼吸道感染的优势EVs种类及其血清型，对防控和临床诊治此类疾病具有重要意义。

利益冲突：无