载脂蛋白AI和B在脂肪肝中的调节作用

高颖

摘要 为研究载脂蛋白AI（apoAI）和载脂蛋白B（apoB）在脂肪肝中的调节作用，采用原代肝细胞体外培养来培养大鼠肝细胞。正常贴壁培养的肝细胞分别用1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L的DL-乙硫氨酸处理，在24、48 h时测定对照组及处理组细胞裂解液中apoAI、apoB、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）的含量。结果表明，肝脏极低密度脂蛋白（VLDL）的合成限速关键物质是apoB，而VLDL又对甘油三酯（TG）起主要输出作用。apoB的降低可能是肝脏脂肪变性发展的重要因素，因此确立apoB作为脂肪性肝炎的预测指标。

关键词 细胞培养;脂肪肝;载脂蛋白;脂蛋白

Abstract In order to investigate regulating metabolism of apoAI，apoB on fatty liver， rat hepatocytes were cultured by the method of primary cultured hepatocytes in vitro culture. The normal adhered hepatocytes were treated with 1.0， 2.0， 3.0， 4.0， 5.0 mmol/L DLethionine and the concentration of apoAI， apoB， LDL， HDL in cell lysate for 24 and 48 hours between treating respectively were measured. The results showed that VLDL was a major terminal route of lipoprotein B in the liver， and composition of apoB was the compositive ratelimiting step in VLDL. The significant factor of liver fatty degeneration incriminated apoprotein B degrading， thus apoB was established as a preindex on nonalcoholic steatohepatitis.

Key words Hepatocyte culture;Fatty liver;Apoprotein;Lipoprotein

载脂蛋白、细胞膜脂蛋白受体、脂代谢酶是介入脂蛋白代谢过程的主要因素，这是一个复杂的相关联的动态过程。载脂蛋白是血浆脂蛋白的主要成分，而apoB参与低密度脂蛋白受体（LDLR）的识别，是构成其的主要蛋白质。LDL 通过apoB 与 LDLR 结合进入细胞内，抑制内源性胆固醇的合成并降低 LDLR 数目，对胆固醇代谢起着自我反馈的作用[1-2]。因此，载脂蛋白对血浆脂蛋白的代谢效率起控制性作用。笔者通过体外培养肝细胞、添加药物、生化指标测定等方法来检测肝细胞内载脂蛋白和脂蛋白的含量变化，分析载脂蛋白对调节脂蛋白、甘油三酯含量的作用，从新的角度展开载脂蛋白在体内对脂代谢相互作用的研究，以期为药物研发提供新的实验手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物。

SD大鼠，雄性，100～150 g，清洁级，健康，由河北省实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂。

根据参考文献[3-5]配制预灌流液、细胞洗液，培养基，预热至37 ℃，备用。载脂蛋白AI試剂盒、载脂蛋白B试剂盒、直接高密度脂蛋白试剂盒、直接低密度脂蛋白试剂盒，置于室温下备用。

1.1.3 主要仪器。

二氧化碳恒温培养箱，为日本SANYO公司产品;超净工作台，为德国Heraeus公司产品;倒置相差显微镜成像系统，为OLYMPUS公司产品;24孔细胞培养板，为NUNC公司产品;A-6型半自动生化分析仪，为北京松上技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 原代肝细胞的分离与培养。

取成年SD大鼠，速眠新麻醉，采用二步灌流法获取肝细胞[6-10]。用200目尼龙网布过滤，收集滤液，以800 r/min离心3 min，去上清液，将肝细胞加入培养基中重新悬浮，用移液管吹打几次，混匀，再次离心，重复2次。计数板染色，观察细胞总数和细胞活力，24孔板铺入细胞，二氧化碳恒温培养箱中培养24 h。

1.2.2 DL-乙硫氨酸处理大鼠肝细胞。

待细胞附着贴壁培养24 h后，用倒置相差显微镜观察细胞生长情况。用1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L DL-乙硫氨酸处理贴壁生长良好的肝细胞，分为对照组（A）和处理组（B、C、D、E、F），每组6个重复，24 h换液1次。将细胞与裂解液一并转入离心管，混匀，12 000 r/min离心10 min，取上清液待测。

1.2.3 生化指标测定。

按照试剂盒说明书，利用生化分析仪分别测定A、B、C、D、E、F组24和48 h细胞裂解液中apoAI、apoB、LDL、HDL的含量。

1.2.4 数据统计与分析。

采用单因子方差分析（One-way ANOVA），0.01

2 结果与分析

2.1 DL-乙硫氨酸对apoAI和apoB含量的影响

肝细胞中测定的生化指标结果表明，DL-乙硫氨酸作用24 h时，处理组各组apoAI含量与对照组差异极显著（0<P<0.01）;处理组B、C、D、E组apoB含量与对照组差异极显著（0<P<0.01），F组与对照组差异不显著（P>0.05）。作用48 h时，处理组各组与对照组apoAI、apoB含量差异极显著（0<P<0.01）（表1）。

2.2 DL-乙硫氨酸对LDL和HDL含量的影响

肝细胞中测定的生化指标结果表明，DL-乙硫氨酸作用24 h时，处理组各组LDL含量与对照组差异极显著（0

3 讨论

肝细胞分解代谢脂蛋白与细胞膜上的脂蛋白受体结合物受载脂蛋白的影响。血液不能直接转运疏水性物质，其也不能直接进入组织细胞中，因此甘油三酯和胆固醇都必须与血液中的特殊蛋白质和极性类脂合成脂蛋白，以便在血液中运输并进入肝细胞。肝内的脂蛋白被VLDL运到肝外组织去贮存和利用。

该试验中apoAI和apoB含量的变化趋势，分别与HDL、LDL的变化相关。肝脏内蛋白质的合成障碍减少了负责将TG转运出肝脏的载脂蛋白B的复合物，从而使VLDL转运不出去，TG含量升高，DL-乙硫氨酸代替甲基而提供乙基就是利用了这一点。apoAI和HDL的含量随着DL-乙硫氨酸浓度的增加而升高。HDL的合成场所主要在肝脏内，当乳糜微粒（CM）和VLDL中的甘油三酯水解时，apoAI脱离其表面形成HDL。apoA是运输HDL的主要载脂蛋白，这证实了apoAI的含量越高，形成的HDL也越多。apoB控制着VLDL的转运，当apoB含量下降时肝细胞内的VLDL含量增加，TG含量也升高。

载脂蛋白B的相关性研究用于心血管疾病、脂蛋白血症、肥胖和胆囊疾病的临床应用更加实用化，为患者提供早期预测、实施正确的治疗方案和进行治疗效果的评估奠定基础。

参考文献

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