猪瘟病毒云南流行毒株E2基因遗传变异分析

蓝睿　刘应华　苏云顺　王馨娴　赵谦　尹革芬

摘  要：为了解云南省猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）流行毒株E2基因的遗传变异情况，试验采用RT-PCR检测云南省疑似猪瘟阳性样品，并获取4株E2全基因序列。对所获的E2基因序列与国内外参考毒株进行同源性和遗传进化树比对分析。结果表明，获得4条全长均为1 119 bp的云南省CSFV流行毒株E2全基因序列。4株云南毒株序列的同源性为81.7%～99.6%，与疫苗毒株的同源性为81.3%～94.5%，与其他參考序列的同源性为81.8%～99.6%。遗传进化分析表明，4株云南流行毒株分为两个不同的进化分支，1株流行毒株和疫苗毒株同属于1.1基因亚型，其他3株流行毒株分布在另一进化分支上，属于2.1c基因亚型，研究结果为云南地区猪瘟的防控提供了一定的理论参考。

关键词：猪瘟病毒;E2基因;遗传变异

中图分类号：S852.65 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2020）06-0032-06

猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起猪的一种病毒性疾病，具有传染性高和传播范围广的特征，严重时发病剧烈、高烧不退甚至伴有全身败血性症状，世界各地都有流行，是国际兽疫局要求必须上报的疾病之一，也是猪病中危害性最大且重视程度最高的动物传染性疾病之一[1]。

CSFV只有一个血清型。根据5非编码区、E2基因和NS5B聚合酶基因的序列数据系统发育分析，CSFV分为三种基因型：1型、2型和3型，每种基因型进一步分为3个或4个基因亚型。其中CSFV基因亚型2.1在国内外流行最广，并被进一步分为CSFV基因亚型2.1a、CSFV基因亚型2.1b和CSFV基因亚型2.1c[2]。CSFV的四种基因亚型（1.1、2.1、2.2和2.3）在我国广泛流行，其中CSFV基因亚型2.1b在过去10年中逐渐成为我国主要的流行毒株。本研究通过调查云南省CSFV流行株E2基因的遗传变异，分析云南省部分地区CSFV流行毒株与疫苗毒株的突变情况，为猪瘟防治提供合理科学的理论依据。

1  材料与方法

1.1  样品及疫苗

本试验样品为2018年云南省各地区猪场200份疑似猪瘟的送检样品，通过RT-RCR得到4个来自楚雄州某猪场、红河州某猪场和曲靖市某猪场病猪的淋巴结、肾脏和脾脏等阳性样品;新温必沙猪瘟活疫苗购自吉林和元生物工程股份有限公司。

1.2  试验试剂

RNAiso Plus、DL2000 Marker和EcoR I限制酶购自宝生物工程（大连）有限公司;Easy First-Strand cDNA SuperMix和2×TransTag HIFI Mix II（-dye）购自北京全式金生物技术有限公司;琼脂糖购自白赛勤化学技术有限公司;pClone007 Vector Kit和TreliefTM 5α Chemically Competent Cell购自北京擎科新业生物技术有限公司。

1.3 引物来源

扩增CSFV E2全基因引物参照文献获取和合成[3]，引物信息如表1所示。

1.4 CSFV E2全基因扩增

按照RNAiso Plus试剂盒说明书处理样品和提取核酸。将提取的RNA按照2×ES Reaction Mix 5 μL、EasyscriptTM RT/RI Emzyme Mix 0.5 μL、下游引物      1 μL和模板RNA 3.5 μL的反应体系以及    42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min的反应程序进行反转录。CSFV E2基因PCR扩增反应体系为：2×Trans HiFiII 12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL和cDNA 1.0 μL，反应体系为      25 μL。扩增程序为94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s和72 ℃ 40 s，循环35次;72 ℃ 5 min。取10 μL PCR扩增产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 CFSV E2全基因分子克隆

将1.3.2中扩增的PCR产物回收纯化后连接到pClone007载体，转化至感受态细胞TrelieTM 5α中，连接转化具体操作步骤按照pClone007 Vector Kit和TreliefTM 5α Chemically Competent Cell试剂盒说明书进行。摇菌后按照试剂盒操作说明书提取重组质粒。

1.6 质粒酶切鉴定及测序

37 ℃水浴锅中用EcoR I限制酶单酶切质粒1 h～3 h，接着用1.5%琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳鉴定（酶切位点信息如表2所示），最后将鉴定正确的质粒送去测序。酶切体系：EcoR I限制酶1 μL、10×缓冲液2 μL、DEPC 16 μL、质粒  1 μL，总反应体系20 μL。

1.7 基因同源性比较和遗传进化树分析

利用Megalign软件比较本试验获取的流行毒株与GeneBank基因库中参考毒株E2全基因序列的同源性，建立遗传进化树对遗传关系进行分析，参考毒株序列信息如表3所示。

2  结果

2.1 CFSV E2全基因PCR扩增

利用CFSV E2基因引物扩增云南省4个地区病猪的CFSV阳性组织样品，PCR扩增产物电泳结果显示，得到与预期片段大小（1 343 bp）相符的条带（图1）。

2.2 CSFV E2全基因目的片段的純化

PCR扩增目的基因并通过1%琼脂糖凝胶电泳富集PCR产物，结果显示目的片段大小为1 343 bp，与预期结果相符（图2）。根据胶回收试剂盒操作说明进行目的片段回收，回收产物经电泳检测，目的片段大小与预期结果相符（图3）。

2.3 CSFV E2目的片段酶切鉴定结果

重组质粒用EcoR I限制酶进行单酶切，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示，酶切结果出现1 408 bp和1 846 bp两个片段，其中目的片段约为1 408 bp，与预期相符，见图4。

2.4 CSFV E2全基因序列同源性分析

本次试验将云南省不同地区获得的4株CSFV云南流行毒株分别命名为YN-QJ、YN-HH、YN-HH2和YN-CX，疫苗毒株命名为YM-2，具体信息见表4。用DNA Star 6.0中Editseq、Seqman以及Megalign离线软件对4株CSFV流行毒株的E2基因序列、1株疫苗毒株序列和17株参考序列进行比对分析，可知同源性为81.8%～99.6%，表明E2基因同源性存在较大差异，4株CSFV流行毒株间的基因同源性为81.7%～99.6%，与疫苗毒株同源性为81.3%～94.5%，见图5。

2.5 CSFV E2基因遗传进化分析

为进一步分析CSFV云南地方流行毒株与CSFV国内外分离株基因组之间的亲缘关系，用GenBank中获取的17株CSFV国内外参考毒株与4株CSFV云南地方流行毒株的E2基因序列构建基因遗传进化树，结果显示本试验获得的4株CSFV云南流行毒株和疫苗毒株属于1亚群和2亚群，主要分布在2.1分支和1.1分支上，而2.1亚型主要以2.1c为主。流行毒株YN-HH、YN-HH2和YN-CX分布在CSFV的2.1c基因亚型分支上，而毒株YN-QJ和疫苗毒株YM-2的亲缘关系较近，均分布于CSFV的1.1基因亚型，并未发现CSFV的其他基因型或基因亚型（2.2亚型、2.3亚型和基因3型）的毒株，遗传进化树见图6。

3  讨论

E2基因是CSFV基因组中最容易发生变异的区域，使CSFV更能适应环境的变化。这种变异性直观地反映了CSFV流行毒株关键抗原表位的变异，这也是导致疫苗接种失效的原因之一。该基因的2 508～2 697位核苷酸序列（190 bp）是公认用于分析CSFV的遗传变异的片段之一，具有最好的鉴别能力和最高的置信度，它能区分核苷酸差异很小的毒株。因此，该片段普遍用于CSFV的多样性分析。E2基因的分析结果不仅可反映毒株的遗传关系，还关联着毒株间的免疫关系。此外，CSFV的中和性抗原表位都位于gp55囊膜糖蛋白上，该蛋白可以诱导机体产生保护反应，参与病毒感染细胞的过程，因此E2基因在CSFV分子流行病学研究中备受重视。

20世纪40年代分离到的石门毒株与70～80年代分离到的HeNZZ1/82毒株以及90年代分离到的BJCY1/96、BJTX3/96和GDGZ1/95毒株的E2基因同源性高达99.1%，说明E2基因的高变区在某种程度上呈现一定的稳定性;20世纪90年代分离到的3株毒株HeBHH1/95株、HeNXH2/98株和GHBH1/98株与猪瘟兔化弱毒C株的核苷酸的同源性均为100%，这表明CSFV流行株的E2变异呈现一定的多样性，向远离疫苗株的方向发生变异[4]。2006—2007年辽宁省CSFV流行毒株已经从基因1型向基因2型转变，与CSFV的石门毒株和兔化弱毒株在基因序列间存在较大的差异，也在向远离疫苗毒株的方向现发生变化[5]。本试验通过RT-PCR和分子克隆及测序，获得了4株CSFV云南流行毒株和1株CSFV疫苗毒株的E2基因核苷酸序列，基因全长均为1 119 bp。将获取的4株CSFV流行毒株与国内外不同分型的18株CSFV参考序列进行基因同源性比较和构建基因遗传进化树分析。结果显示，4株CSFV云南流行毒株间的核苷酸同源性为81.7%～99.6%;CSFV疫苗毒株与CSFV流行毒株的核苷酸同源性为81.3%～94.5%，其中3株CSFV流行毒株与CSFV疫苗毒株的同源性相对较低，表明云南省CSFV流行毒株在基因上产生了不同的遗传变异。基因遗传进化树分析显示，4株CSFV云南流行毒株中仅有1株CSFV流行毒株和CSFV疫苗毒株在一个分支上，属于1.1基因亚型。其他3株CSFV流行毒株分布在另外一个进化分支上，属于2.1c基因亚型，进一步表明在云南流行的CSFV流行毒株在遗传上出现了进化的差异。云南省不同地区当前部分流行的CSFV呈现遗传变异多样性，这与国内其他区域研究CSFV的变化趋势一致[6-7]。因此，有必要长期在云南省开展CSFV的分子流行病学调查，为猪瘟的防控提供理论和技术参考。

参考文献：

[1] 宋淑英，张泽辉，王庄. 猪瘟病毒结构蛋白的研究进展[J]. 湖北畜牧兽医，2015，（10）：99-100.

[2] 陶玉顺，黄涛，袁东波，等. 目前我国猪瘟的流行现状及防控策略[J]. 畜牧与兽医，2008，（8）：90-94.

[3] 毛泽明，加春生，毛泽天，等. 规模化猪场猪瘟发病新特征及预防[J]. 黑龙江畜牧兽医，2014，（10）：46-47.

[4] 郭焕成，席进，刘帅，涂长春. 猪瘟病毒基因分型寡核苷酸芯片方法的建立[J]. 中国兽医学报，2012，32（2）：177-181，211.

[5] Bhaskar N， Ravishankar C， Rajasekhar R， et al. Molecular typing and phylogenetic analysis of classical swine fever virus isolates from Kerala， India[J]. Virus Disease， 2015，26（4）：260-266.

[6] Postel A， Schmeiser S， Bernau J， et al. Improved strategy for phylogenetic analysis of classical swine fever virus based on full-length E2 encoding sequences[J]. Veterinary Research， 2012， 43： 50.

[7] Jiang D L， Gong W J， Li R C， et al. Phylogenetic analysis using E2 gene of classical swine fever virus reveals a new subgenotype in China[J]. Infect Genet Evol， 2013， 17： 231-238.