仔猪不同生长阶段粪便微生物多样性分析

刘亚丹　左周　秦军军　杨阳　蔡春波　赵燕　郭晓红　曹果清　李步高　高鹏飞

摘  要：旨在利用高通量测序技术分析晋汾白猪和马身猪生长早期粪便微生物的多样性特征及其可能的成因。本研究以马身猪和晋汾白猪为研究对象，采用16S rRNA高通量测序技术，对仔猪初生（1日龄）、断奶（28日龄）和保育后期（70日龄）三个关键的生长发育阶段的粪便微生物多样性进行研究。结果表明：本次测序所得的操作分类单元分属25个门、43个纲、91个目、163个科和470个属的微生物。多样性分析表明，生长在相同环境之下的晋汾白猪和马身猪在不同的生长阶段粪便微生物的组成具有相似之处，初生（1日龄）时容易受到母体及周围环境的影响，假单胞菌和志贺菌属等有害菌属的细菌含量较高，乳酸杆菌的数量随着仔猪年龄的增长而逐渐增加，在断奶（28日龄）和保育末期（70日龄）时粪便微生物菌群的多样性更为相似;在保育末期，两个猪种的仔猪肠道中普雷沃氏菌和毛螺菌科NK4A136等有助于动物消化代谢的细菌更为丰富。本研究的结果可为仔猪肠道微生物定植以及演替的变化规律提供理论参考。

关键词：猪;粪便微生物;16S rRNA;菌群多样性

中图分类号：S828.8 文獻标志码：C 文章编号：1001-0769（2020）06-0022-08

仔猪的饲养管理对生猪生产至关重要，其健康状况是影响生猪行业经济效益的首要因素。在生长发育阶段，仔猪容易受一些因素的影响，导致生长速度缓慢和饲料转化率差，并会引发腹泻等疾病。肠道微生物组成是决定仔猪是否会出现上述问题的重要因素之一。猪的肠道微生物主要由细菌、真菌、古细菌和病毒等组成，其中细菌占据着绝对的优势，且大多数细菌为厌氧菌[1]。猪的肠道微生态物对机体的生长发育有重要的作用，对促进机体的物质和能量交换、信息传递、宿主营养物质的吸收和均衡、免疫以及促生长起着非常重要的作用[2-6]。

随着生物技术的发展，越来越多的先进技术被用于微生物的研究，其中16S rRNA基因测序技术被广泛用于研究动物肠道微生物菌群的多样性和组成等，为更深层次的研究提供了便利的条件。Chen等采用16S rRNA测序技术分析了仔猪肠道内容物组成的变化，发现仔猪断奶后其肠道分泌物中的菌群组成会发生明显的改变，肠道微生物的α多样性随时间的增长而显著增加，并在断奶后10 d左右达到相对稳定的状态[7]。Alain等研究了哺乳仔猪粪便中微生物组成的变化，发现厚壁菌门和拟杆菌门的细菌是其肠道内的主要细菌;在哺乳期的后期，厚壁菌门细菌的数量明显高于拟杆菌门细菌的。

马身猪是山西省的一个优良的地方品种，具有繁殖力高、肉质好和抗逆性强等特点，但生长速度相对较慢。晋汾白猪是以马身猪（6.25%）、太湖猪（3.13%）、长白猪（40.62%）和大白猪（50%）为亲本杂交培育的品种，继承了马身猪肉品质好和抗逆性强等优点，而且生长速度显著高于马身猪。本研究以马身猪和晋汾白猪为试验动物，对这两个品种的仔猪在出生后第1天（初生）、第28天（断奶）和第70天（保育末期）三个时期粪便中的微生物进行了16S rRNA测序，通过粪便微生物组成的变化情况分析仔猪粪便微生物的多样性特点，为更深入地研究猪肠道微生物菌群的特征以及对动物生长发育影响的研究提供理论参考。

1  材料与方法

1.1 试验动物的饲养与样品采集

按照农业农村部发布的（NY/T 65-2004）《猪饲养标准》，统一将试验动物饲养于山西省大同市种猪场。在组建猪群时，从马身猪和晋汾白猪的母猪群中分别选择年龄相同且体重接近的母猪进行同期发情和配种，并在分娩前后封锁不良的症状，喂给不含益生菌、抗生素或其他药物的饲料。这些母猪所产的仔猪在初生、断奶和保育末期按屠宰要求分别进行屠宰（屠宰前禁食8 h，禁食期间可自由饮水）;在相同条件下，通过直肠擦拭法采集新鲜的粪便样品，采集后将同品种、同日龄和同窝仔猪的样品混合为一组，置于冻存管，在液氮中保存。两个品种的每个采样点的粪便样品随机抽取3份进行16S rRNA测序分析。

1.2 DNA提取、PCR扩增和16S rRNA测序

按照QIAamp Fast DNA stool mini试剂盒（美国加利福尼亚州Qiagen公司）的操作说明，从200 μL粪便样品中提取微生物基因组DNA。根据NCBI数据库中微生物16S rRNA基因的V3和V4区域[9]设计引物341F（5?-CCTAYGGGRBGCASCAG-3?）和806R（5?-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3?），进行PCR扩增。PCR产物利用Illumina MiSeq测序平台进行测序[10-11]。去除Raw data中含N>10%的序列，同时去除序列质量低于80%的序列（Q-value>20）。利用FLASH软件对序列进行拼接，最小overlap长度为10 bp，overlap区允许的最大错配率为0.2[12]。采用Trimmomatic软件对拼接质量进行质控和数据优化。

1.3 操作分类单元菌群聚类分析

使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME，version 1.17）[13]软件对测序所得原始数据进行质量控制，移除模糊碱基或者片段较大的片段末端读数。利用Usearch（vsesion7.0）软件[14]按照97%相似性对非重复序列进行操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚类，基于Silva（https：//www.arb-silva.de/）数据库[15]，对所得OTU在不同分类学水平上进行注释，生成结果进行分析。

1.4 肠道微生物多样性分析

利用Mothur（version v.1.30.1）[16]软件计算物种微生物的α多样性。表示微生物菌群丰富度的指数有Ace和Chao;计算微生物菌群多样性的指数为Shannon;反映菌群系谱多样性的指数是PD。利用T检验分析组间α多样性的显著性差异。使用97%相似度的OTU，利用R Studio（v.3.0.2）中工具制作稀释曲线图[17]。基于非加权的UniFrac（unweighted UniFrac）距离[18]和主成分分析（Principle co-ordination analysis，PCoA）计算样品间的β多样性。

1.5 微生物分类学分类及统计分析

根据对比SILVA细菌数据库[15]（Release 128 http：//www.arb-silva.de）的结果，采用RDP classifier贝叶斯算法[19]对OTU代表序列进行分类学分析，然后在门（phylum）、纲（class）、目（order）、科（family）及属（genus）水平上统计每个样品中肠道微生物的组成。使用Wilcoxon秩和检验（Wilcoxon rank-sum test）对两个品种猪的各个日龄及品种间微生物群落在属水平上进行假设检验，评估物种在丰度上存在的差异，分析组间显著性差异。利用LEfSe软件，根据分类学组成对样品按照不同的分组条件进行线性判别分析，获得对两个品种的仔猪各阶段产生显著影响的微生物属。

2  结果与分析

2.1 16S rRNA测序质量评估

采用Mothur软件进行稀释曲线分析，结果见图1。

图1分别呈现了样品覆盖率（coverage）和Sobs稀释曲线。测序样品的平均覆盖率为97.82%，coverage和Sobs稀释曲线趋向平坦并最终达到平台期，说明测序数据能够反映样品中菌群多样性信息可以满足后续分析的要求。

2.2 OTU菌群聚类分析结果

通过OTU菌群聚类发现，本研究所得的OTU分属25个门、43个纲、91个目、163个科和470个属的微生物。测序样品结果经优化处理后，共获得938 912条有效序列，每个物种的平均有效序列数为52 162条，平均长度是436 bp。

2.3 不同猪种的仔猪粪便微生物α多样性分析

晋汾白猪和马身猪仔猪粪便微生物多样性分析结果见图2。

根据图2中的Ace和Chao指数可知，两个品种的仔猪粪便微生物的丰富度均在初生阶段达到最高水平，且两猪种间没有统计学意义上的显著差异（P>0.05），菌群丰度随着仔猪日龄的增加呈现逐渐下降的趋势，断奶和保育阶段菌群的丰度基本稳定。图2中的Pd指数表明，两个品种的仔猪粪便微生物系谱多样性在初生阶段达到最高，且晋汾白猪的粪便微生物系谱多样性高于马身猪的，但差异不显著（P>0.05），断奶阶段逐渐稳定。根据图2中的Shannon指数可知，两个品种的仔猪粪便微生物菌群多样性整体趋势相似，均是在仔猪初生阶段相对较低，且晋汾白猪粪便菌群多样性在统计学意义上显著高于马身猪的（P<0.05）;与初生阶段相比，两猪种的仔猪断奶时粪便菌群多样性均在统计学意义上显著增加（P<0.05）;与断奶阶段相比，保育阶段的粪便菌群多样性也呈增加的趋势，但差异不显著（P>0.05）。

2.4 粪便微生物主成分分析结果

基于加权UniFrac距离进行了主成分分析，分析结果见图3。

由图3可知，第一主成分方向为菌群多样性，占总变异的33.7%，从左向右依次为晋汾白猪和马身猪第1日龄及28日龄的粪便样品，然后是70日龄的粪便样品。第二主成分为菌群均匀度，占总变异的14.89%。结果表明，年龄对猪粪便微生物多样性有较大的影响，两猪种1日龄仔猪的粪便微生物聚在一起，两个品种仔猪28日齡和70日龄时的粪便微生物菌群多样性更为相似。

2.5 不同品种微生物分类学分析

对两个品种仔猪粪便中微生物门水平组成结构进行分析后发现，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的细菌在两个品种仔猪的3个生长阶段的粪便中都存在，且随着仔猪年龄的增长粪便微生物的丰度逐渐增加，变形菌属（Proteobacteria）的细菌在仔猪初生阶段的粪便中丰度较高，晋汾白猪和马身猪仔猪粪便中的比例分别为46.67%和40.16%，随着日龄增长逐渐下降（图4）。

由图4可知随仔猪年龄的推移粪便微生物组成结构在属水平上存在显著差异：初生时，粪便微生物丰度较高的细菌主要是梭状芽孢杆菌1（Clostridium_sensu_stricto_1）、假单胞菌（Pseudomonas）和大肠杆菌志贺菌（Escherichia-Shigella）。晋汾白猪粪便中丰度最高的微生物是假单胞菌（32.33%），而马身猪粪便中的假单胞菌仅为晋汾白猪的二分之一（16.89%）;马身猪粪便中丰度最高的细菌是大肠杆菌志贺菌属的细菌（27.14%），然而在晋汾白猪粪便中志贺菌属细菌的丰度仅为马身猪的二分之一（13.96%）。在仔猪的断奶和保育阶段，这些菌属的细菌丰度极显著降低，甚至消失;在断奶阶段，克里斯滕森菌科R-7属（Christensenellaceae_R-7）细菌的丰度最高，约占粪便中总细菌的10.1%，随后分别为拟杆菌属（Bacteroidetes）细菌和乳酸杆菌（Lactobacillus），分别占7.57%和7.0%;在马身猪上，断奶时丰度最高的粪便微生物是乳酸杆菌，占总细菌的14.85%;其次是拟杆菌属S24-7和紫单胞菌属（Parabacteroides）的细菌，分别占11.08%和8.34%。在保育末期，两个品种的仔猪粪便中乳酸杆菌和紫单胞菌属细菌的丰度出现下降的趋势，普雷沃氏菌NK3B31和普雷沃氏菌1的丰度相比断奶阶段的则逐渐增加，其中普雷沃氏菌是晋汾白猪粪便中丰度最高的细菌（10.03%），而普雷沃氏菌NK3B31为马身猪粪便微生物中丰度最高的细菌（12.17%）。

2.6 不同品种肠道微生物肠型分析

两个品种仔猪的粪便微生物肠型分析结果见图5。

图5表明，属水平上的菌群分型结果表明优势菌群结构近似的样品分别聚成三类。晋汾白猪和马身猪在哺乳阶段的粪便微生物主要是假单胞菌，断奶阶段是乳酸杆菌，保育阶段是1型普雷沃氏菌。其中，假单胞菌和乳酸杆菌类群的样品距离更远，1型普雷沃氏菌类群的样品聚集得更为紧密。这三种肠型随着仔猪的生长菌群聚类距离逐渐缩小，说明随着仔猪年龄的增加两个不变的肠道微生物差异逐渐缩小。

3  讨论

数以万计的微生物栖息在动物肠道中并与宿主形成了互惠互利的关系，这些共生微生物被称为微生物群[20]。平衡稳定的肠道微生物菌群结构是维持动物健康的重要条件，而微生物菌群的结构与众多的因素相关，如动物的品种、采食方式、生长环境和健康状况等先天及后天因素的影响。有研究表明，不同品种的猪肠道微生物菌群结构组成差异显著[21]。Chen等研究发现，母乳中的细菌最主要是厚壁菌门、链球菌门和拟杆菌门的细菌，在吮吸母乳的仔猪肠道中也检测到了相同的菌群，从而证实了母乳对仔猪早期肠道微生物定植所起的作用[22]。不同品种的动物在相同的环境中生活数月之后，其肠道内的微生物会因为采食方式的不同在微生物的组成和结构上发生变化[23-24]。本研究与上述研究结果相似，晋汾白猪和马身猪的粪便微生物在初生阶段因为品种的差异存在明显的不同，但随着年龄的不断增加，采食和生长环境逐渐成为主导肠道微生物组成的主要因素，两个品种仔猪的粪便微生物差异逐渐缩小，并最终趋于稳定。

有研究表明，大肠埃希菌属和志贺菌属的细菌会造成动物的腹泻，从而引发大规模的流行性疾病[25]。哺乳阶段，梭杆菌门的细菌在两个品种仔猪粪便中具有相对较高的丰度，它和一些致病菌常常存在于哺乳期的仔猪肠道内，会引发腹泻和肠炎等疾病[26]。对晋汾白猪和马身猪的仔猪粪便微生物组成结构及差异分析后发现，在初生阶段，志贺菌属细菌和假单胞菌在晋汾白猪和马身猪的粪便中有较高的丰度。有研究发现给新生仔猪补充乳酸杆菌有助于动物的早期发育，并可通过调节新生仔猪肠道菌群的方式改善肠道健康，减少新生仔猪肠道中大肠杆菌和梭菌的数量，从而预防新生仔猪腹泻[27-28]。哺乳阶段到断奶阶段，仔猪的采食方式发生变化，由原来吮吸母乳转为采食较难消化吸收的固态颗粒饲料，因此需要更多的能够促进动物消化的乳酸菌群。在此阶段，仔猪肠道中乳酸杆菌类细菌的丰度逐渐升高。在本研究中，乳酸杆菌在仔猪哺乳期的肠道中丰度较小，随着仔猪年龄的增长有所提高，說明早期饲喂乳酸杆菌有助于仔猪肠道细菌的稳定，减少仔猪腹泻等疾病的发生。普雷沃氏菌属的细菌参与淀粉的降解，与葡萄糖代谢呈正相关，为动物机体提供生长发育所必需的能量，并且可以通过供能的方式来维护肠道健康[29]。拟杆菌属S24-7科细菌能够抑制动物肠道内的炎症反应，在维护肠道健康上发挥着重要的作用[31]，有研究发现它与机体的能量代谢和丁酸盐代谢密切相关[30]。本研究发现，保育期末期，晋汾白猪和马身猪粪便中普雷沃氏菌属细菌、拟杆菌属S24-7细菌和毛螺菌科NK4A136细菌均达到一定的丰度水平且趋于稳定，说明保育期末仔猪肠道微生物组成已基本趋于稳定。

有研究表明，仔猪断奶后因为较多地采食富含复合碳水化合物的谷类饲料，其肠腔内的pH和发酵产物的生理特性受到了影响，这种变化可能是由于断奶后肠道中普雷沃氏菌的数量不断增加所致[21]。普雷沃氏菌属的细菌有助于分解食物中的蛋白质和碳水化合物，不仅参与宿主的多糖降解和氨基酸代谢，还能够防御葡萄糖耐受不良，促进肝糖原的储存[33-34]。上述研究的结果与本研究中保育期仔猪粪便中普雷沃氏菌丰度较高的结果相一致。

本研究利用16S rRNA测序技术分析了晋汾白猪和马身猪生长早期粪便微生物的多样性特征，发现猪粪便微生物菌群的丰度和多样性随着猪年龄的增长而不断变化。初生仔猪粪便微生物受母体和周围环境的影响很大，导致这一时期假单胞菌属和志贺菌属等有害菌属的细菌有比较高的丰度。随着仔猪年龄的不断增长，其肠道中有益菌逐渐占据优势，丰度提高，肠型也发生了改变。本研究的结果可为仔猪肠道微生物定植以及演替的变化规律提供理论参考。

参考文献：（34篇，略）