Sitagliptin对大鼠肢体缺血再灌注损伤的保护作用

兰俊　王济纬　许荣成　陈科

【摘要】 目的 研究磷酸西格列汀（Sitagliptin）對大鼠肢体缺血再灌注损伤的保护作用。

方法 8周龄健康清洁级SD大鼠30只， 随机分为假手术组（S组）、肢体缺血再灌注组（IR组）、Sitagliptin治疗组（SIR组）， 各10只。实验前给SIR组的SD大鼠喂养Sitagliptin， 600 mg/（kg·d）， 共3 d。采用环扎双后肢近心端4 h后再灌注4 h的方法建立大鼠肢体缺血再灌注损伤模型。S组仅麻醉， 不阻断后肢血供， 8 h后处死取骨骼肌（腓肠肌）标本。IR组和SIR组， 建立大鼠肢体缺血再灌注损伤模型， 缺血4 h后再灌注4 h， 然后处死大鼠取腓肠肌标本。腓肠肌标本通过HE染色观察腓肠肌组织。另取腓肠肌标本保持冰浴匀浆， 取上清液进行测定丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）的活性。

结果 腓肠肌组织切片HE 染色显微镜下观察， 发现S组大鼠腓肠肌组织细胞排列规则有序， 肌纤维连续无断裂。IR组大鼠腓肠肌组织结构紊乱， 横纹不清， 出现断裂， 上述改变在SIR组得到好转。S组SOD活性为（90.72±6.16）U/ml， MDA水平为（41.90±11.18）nmol/（mg·prot）;IR组SOD活性为（61.04±5.37）U/ml， MDA水平为（82.25±13.39）nmol/（mg·prot）;SIR组SOD活性为（70.87±6.23）U/ml， MDA水平为（68.31±14.95）nmol/（mg·prot）。IR组及SIR组MDA水平高于S组， SOD活性低于S组;SIR组MDA水平低于IR组， SOD活性高于IR组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论 Sitagliptin能减轻腓肠肌缺血再灌注损伤大鼠腓肠肌组织病变， 降低大鼠肢体缺血再灌注损伤组织内MDA的活性、增加SOD的活性， 对肢体缺血再灌注损伤大鼠的骨骼肌具有保护作用。

【关键词】 Sitagliptin;缺血再灌注损伤;骨骼肌;大鼠

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.18.089

Protective effect of Sitagliptin on limb ischemia-reperfusion injury in rats   LAN Jun， WANG Ji-wei， XU Rong-cheng， et al. Department of Orthopaedics， Lishui Peoples Hospital， Lishui 32300， China

【Abstract】 Objective   To study the protective effect of Sitagliptin on limb ischemia-reperfusion injury in rats. Methods   A total of 30 healthy and clean SD rats at 8 weeks of age were randomly divided into sham operation group （S group）， limb ischemia-reperfusion group （IR group）， Sitagliptin treatment group （SIR group）， with 10 rats in each group. SD rats in SIR group were fed Sitagliptin for 3 d， 600 mg/（kg·d）. The rat model of limb ischemia-reperfusion injury was established by ligating the proximal end of both hind limbs for 4 h and then reperfusion for 4 h. S group was anesthetized without blocking the blood supply of hind limbs， and the rats were killed and their skeletal muscles （gastrocnemius） were taken 8 h later. In IR group and SIR group， the rat limb ischemia-reperfusion injury model was established， and after 4 h of ischemia and 4 h of reperfusion， the gastrocnemius muscle samples were taken from the rats. Gastrocnemius tissues were observed by HE staining. In addition， the muscle samples were kept in ice bath homogenate， and the supernatant was taken to measure the activities of malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD）. Results   Gastrocnemius muscle sections were observed under microscope after HE staining and found that the gastrocnemius tissue cells of S group were arranged regularly and the muscle fibers were continuous without breakage. In the IR group， the gastrocnemius muscles were structurally disordered， with unclear stripes and fractures， and these changes were improved in SIR group. SOD activity and MDA level of S group were （90.72±6.16） U/ml， （41.90±11.18） nmol/（mg·prot）， which were （61.04±5.37）U/ml， （82.25±13.39） nmol/（mg·prot） in IR group， and （70.87±6.23） U/ml， （68.31±

14.95） nmol/（mg·prot） in SIR group. MDA level of IR and SIR group were higher than that of S group， and SOD activity was lower than that of S group; MDA level of SIR group was lower than that of IR group， and SOD activity was higher than that of IR group. The difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion   Sitagliptin can reduce the pathological changes of gastrocnemius in rats with ischemia-reperfusion injury， decrease the activity of MDA and increase the activity of SOD in rats with limb ischemia-reperfusion injury， and protect the skeletal muscle of rats with limb ischemia-reperfusion injury.

【Key words】 Sitagliptin; Ischemia-reperfusion injury; Skeletal muscle; Rat

臨床上发生肢体缺血再灌注损伤的情况比较多见， 轻者影响功能， 重者导致肢体坏死， 甚至危及生命， 因而肢体缺血再灌注损伤的防治一直是临床和科研的关注点[1]。使用药物预防具有良好的应用前景， 研究者们已经发现了许多具有减轻骨骼肌缺血再灌注损伤作用的药物[2-6]。Sitagliptin是一种新型的降糖药物， 最近的一些研究已经证实， Sitagliptin对于心脏、肾脏等脏器的缺血再灌注损伤均有保护作用[7， 8]， Sitagliptin是不是也可以对骨骼肌缺血再灌注损伤发挥保护作用， 目前国内外尚无相关研究。本课题组前期工作已经完成了大鼠的腓肠肌缺血再灌注损伤的模型， 并利用这个模型证实了地稔预处理对大鼠肢体缺血再灌注损伤具有保护作用[9]。本组研究再利用这个模型， 通过预先给予大鼠摄入Sitagliptin的方法研究Sitagliptin是否对大鼠的腓肠肌缺血再灌注损伤具有保护作用。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 动物 8周龄健康清洁级SD大鼠30只（质量200～250 g）， 雄雌不限， 由温州医科大学实验动物中心提供。许可证号：SYXK（浙）2010-0150。实验前进行适应性饲养， 手术操作前12 h禁食， 自由饮水。分组：SD大鼠随机分为假手术组（S组）、肢体缺血再灌注组（IR组）、Sitagliptin治疗组（SIR组）共3组， 各10只。实验操作以每组为一小单元， 每个小单元内实验动物接受操作的顺序由抽签决定。

1. 2 药物和仪器 Sitagliptin（商品名：捷诺维， 杭州默沙东制药有限公司， 规格：100 mg/片）。南京SOPTOP舜宇ST60显微镜， Heraeus Labofuge 400高速冷冻离心机， 上海手术器械厂800型离心机， 南京建成生物工程研究所提供的MDA和SOD检测试剂盒， 北京长风仪器仪表公司生产的水浴锅， 上海光学仪器厂生产的721A型分光光度计。

1. 3 方法 给药方法：按照 Chen YT的方法[10]， 实验前给SIR组的SD大鼠喂养Sitagliptin， 药物剂量

600 mg/（kg·d）， 共3 d， 使用生理盐水溶解成10%的溶液后喂养。

手术方法：大鼠术前12 h禁食， 自由饮水， 术前使用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔内注射麻醉， 每2 h追加1次半量维持麻醉。麻醉成功后， 将大鼠取仰卧位， 四肢使用绳子固定于木板上， 头部利用橡皮带保持合适张力通过上颌部牙齿固定在木板上。S组仅麻醉， 不阻断后肢血供， 8 h后处死取腓肠肌标本。IR组和SIR组， 使用橡皮止血带环绕结扎双后肢根部阻断血流， 并以作者以往改进的方法， 以棉签杆为杠杆调整松紧度[9]， 逐步增加压力， 阻断侧支循环， 使后肢急性缺血趾苍白， 温度降低;4 h后松解结扎， 使后肢颜色恢复红润， 制成缺血再灌注模型;恢复血流灌注4 h后处死取腓肠肌标本。

标本采集：每组大鼠分别取后肢腓肠肌组织约200 mg左右， 用冰生理盐水冲洗， 滤纸拭干后称重， 留待监测MDA水平及SOD的活性。剩余腓肠肌标本取约5 mm×5 mm×2 mm组织， 置于40 g/L中性福尔马林中固定24 h。

MDA水平及SOD的活性检测：大鼠肢腓肠肌组织， 按照1∶9的重量比例加入匀浆介质， 保持冰浴下将骨骼肌匀浆5 min， 得到10%匀浆液。将匀浆液用低温离心机离心2000 r/min， 10～15 min后， 弃去沉淀， 取上清液进行测定。采用比色法检测组织匀浆上清中的MDA水平及SOD的活性。

HE染色观察腓肠肌组织病变：取福尔马林中固定24 h后的标本， PBS清洗3次， 30%、50% 和70% 的酒精依次脱水， 10 min/次。然后于脱水机中进行脱水， 石蜡包埋后再切片。最后按照HE 染色液操作说明进行染色， 显微镜下观察心肌组织病变情况。

1. 4 统计学方法 SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验;组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

腓肠肌组织切片HE 染色显微镜下观察， 发现S组大鼠腓肠肌组织细胞排列规则有序， 肌纤维连续无断裂。IR组大鼠腓肠肌组织结构紊乱， 横纹不清， 出现断裂， 上述改变在SIR组得到好转。

S组SOD活性为（90.72±6.16）U/ml， MDA水平为（41.90±11.18）nmol/（mg·prot）;IR组SOD活性为（61.04±5.37）U/ml， MDA水平为（82.25±13.39）nmol/（mg·prot）;SIR组SOD活性为（70.87±6.23）U/ml， MDA水平为（68.31±14.95）nmol/（mg·prot）。IR组及SIR组MDA水平高于S组， SOD活性低于S组;SIR组MDA水平低于IR组， SOD活性高于IR组， 差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

人体骨骼肌组织对缺血较为敏感， 在运动损伤及创伤、应用止血带时间过长、动脉栓塞及血栓形成等情况时， 发生缺血再灌注损伤的几率很高。下肢缺血再灌注损伤除了导致原发部位骨骼肌的溶解、坏死， 还可波及到远处的非缺血的心、脑、肝、肺、肾等器官造成损伤。表现为组织水肿、毛细血管扩张充血、炎性细胞浸润、血管内皮细胞损伤、细胞肿胀、变性、凋亡甚至组织坏死等等。所以发生骨骼肌缺血再灌注损伤后， 轻者影响功能;重者可导致肢体坏死、全身炎症反应综合征， 甚至多脏器功能衰竭（MODS）， 进而危及生命[1]。

近年来骨骼肌缺血再灌注损伤的防治研究已取得了较多的进展， 发现了许多物理治疗和药物介入的方法， 都有减少IR损伤的作用。物理防治的办法， 比如高压氧、低温疗法、低剂量的激光治疗、缺血的预处理及后处理均被证实能减轻骨骼肌的缺血再灌注损伤。使用药物预防具有更加良好的应用前景， 到目前为止发现许多具有减少骨骼肌缺血灌注再损伤的药物， 比如右美托嘧啶、亚硝酸盐、一氧化碳、一氧化氮、硫酸葡聚糖、泊洛沙姆188、N-乙酰半胱氨酸、水飞蓟素、甘草甜酸、伊索前列素、前列地尔、曲马多等药物， 均具有减少骨骼肌缺血灌注再损伤的作用[2-6， 9]。这些药物作用机制多样， 包括对抗活性氧自由基、保护细胞膜、降低中性粒细胞的活性、抑制环氧化酶和脂氧合酶途径等。

Sitagliptin是默克公司生产的二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂， 是一种新型的降糖药物， 最近的一些研究已经证实， Sitagliptin对于心脏、肾脏等脏器的缺血再灌注损伤均有保护作用， 这种保护作用与胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide-1， GLP-1）的增加有关[7， 8]。骨骼肌组织也有丰富的GLP-1的受体， Sitagliptin是不是也可以对骨骼肌缺血再灌注损伤发挥保护作用， 目前国内外尚无相关研究。

活性氧自由基（Reactive oxygen species， ROS）和活化的中性粒细胞是骨骼肌缺血再灌注时造成原位和远隔器官损伤的主要因素。活性氧自由基主要包括超氧化物阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（-OH）、次氯酸（HClO）和一氧化氮衍生的过氧亚硝基阴离子。组织缺血再灌注损伤时， 产生了过量的活性氧自由基， 远远超出了抗氧化防御体系的清除能力， 导致抗氧化酶比如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）明显减少。此外， 活性氧明显增加周围组织的脂质过氧化反应[11]。脂質过氧化物可分解为醛， 如丙二醛（malondialdehyde， MDA）， 它是双功能基化合物， 能与蛋白质、核酸、脑磷脂等含氨基化合物起反应， 使之发生交联、丧失功能;亦可使某些含疏基的酶失活， 最终导致细胞功能衰竭、凋亡[11]。因而SOD和MDA的活性水平可以反应组织缺血再灌注损伤的严重程度， SOD的下降和MDA的升高提示更加严重的组织缺血再灌注损伤， 反之亦然。

本组研究通过预先给予大鼠摄入Sitagliptin， 再通过建立缺血再灌注损伤模型研究Sitagliptin能否对大鼠的腓肠肌缺血再灌注损伤具有保护作用。研究结果显示， 大鼠的肢体缺血再灌注损伤后， 通过HE染色， 光镜下组织观察可见腓肠肌损伤， 使用Sitagliptin能缓解组织损伤。腓肠肌内MDA活性增加， SOD的活性下降;预先应用Sitagliptin能使缺血再灌注损伤大鼠的腓肠肌组织MDA的下降， SOD的活性增加。上述表明Sitagliptin对大鼠腓肠肌的组织缺血再灌注损伤均由保护作用。

本组研究已经证实Sitagliptin对大鼠腓肠肌的组织缺血再灌注损伤具有保护作用。但这种保护作用， 是不是像Sitagliptin对心肌的保护作用一样， 跟胰高血糖素样肽1的增加有关有关， 还需要后续的研究证实。

综上所述， Sitagliptin能降低大鼠肢体缺血再灌注损伤组织内MDA的活性、增加SOD的活性， 对肢体缺血再灌注损伤大鼠的骨骼肌具有保护作用。其更加详细的作用机制需要进一步的深入研究。

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[收稿日期：2020-03-04]