济宁地区酱菜中乳酸菌的筛选与鉴定

宫华 姜建 王伦 吴晗 陈子钰 李星雨 解瑞宁

摘 要：目的：对从酱菜中筛选出的优质乳酸菌进行形态学观察、探究其最适生长pH，并筛选出降解亚硝酸盐能力强的乳酸菌株。方法：采用平板计数法进行菌数测定，采用革兰染色法对乳酸菌进行观察，利用分光光度法测定乳酸菌在不同PH培养液中OD值。结果：从酱菜中提取出的乳酸菌为革兰氏阳性菌，最适生长pH为6。最终分离得到降解亚硝酸盐能力强的LD-1乳酸菌。结论：酱菜含有乳酸菌并成功筛选出降解亚硝酸盐能力强的乳酸菌。

关键词：酱菜;乳酸菌;革兰染色法;平板计数法;济宁

Abstract：Objective： To observe the morphology of high quality lactic acid bacteria screened from pickles， to explore the optimal growth pH， and to screen out lactic acid bacteria with strong ability of degrading nitrite. Methods： Plate counting method was used to determine the number of bacteria， Gram staining method was used to observe the lactic acid bacteria， and the OD value of lactic acid bacteria in different pH culture medium was determined by spectrophotometry. Results： The Lactobacillus extracted from pickles was gram-positive， and the optimum growth pH was 6. Finally， LD-1 lactobacillus with strong ability of degrading nitrite was isolated. Conclusion： There are Lactobacillus in pickles and lactobacillus with strong ability of degrading nitrite has been successfully screened.

Key words：Pickles; Lactobacillus; Gram staining; Plate count method; Jining

乳酸菌是日常生活中的常见菌，其在人体许多生理活动中起着重要作用[1-4]。在食品中加入乳酸菌，可以提高食品的营养价值、延长保存时间以及改善食品口感。亚硝酸盐广泛存在于人们生活的环境中，土壤、水流以及各种生物体内都含有硝酸盐和亚硝酸盐，很多食品中均含有亚硝酸盐，但含量不高，对人体影响不大，然而食品经过加工后亚硝酸盐的含量会大大增加[5-6]。目前泡菜、酱菜的制作方法比较落后，亚硝酸盐含量高。亚硝酸盐含量问题已成为影响酱菜产业进步与发展的“绊脚石”。酱菜中乳酸菌对亚硝酸盐有降解作用，因此筛选出降解亚硝酸盐能力强的乳酸菌株对人们的生产生活具有重要意义。济宁酱菜口味好，质量高，享誉全国。因此，本文希望从济宁酱菜中提取出降解亚硝酸盐能力强的乳酸菌。

1 材料与方法

1.1 样品

济宁市售的本地酱菜样品

1.2 培养基

MRS固体培养基：葡萄糖10 g，琼脂20 g，蛋白胨5 g，KH2PO42 g，酵母膏2 g，碳酸钙粉末15 g，蒸馏水1 000 mL，PH7.0。液体培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO42 g，酵母膏2 g，蒸馏水1 000 mL，PH7.0。

1.3 试剂

MRS培养基（北京陆桥技术股份有限公司）;碳酸钙（纯度为分析纯）;革兰染色试剂（济南百博生物技术股份有限公司）;无水对氨基苯磺酸（北京西中化工厂）;盐酸萘乙二胺（上海化学试剂分装厂）;生理盐水;甘油等。

1.4 实验设备

超凈工作台（苏州净化设备有限公司）;高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）;平皿;锥形瓶;接种针;分光光度计;恒温培养箱;菌落计数仪;吸光光度计;移液枪等。

1.5 乳酸菌的筛选

1.5.1 乳酸菌的分离

从玉堂酱菜提供的酱菜中随机切取1 g，放入研钵中，加入1 mL生理盐水，充分研磨，静置15 min，放入超净工作台中。将玉堂酱园酱菜样品用生理盐水按10-1～10-3浓度梯度稀释：准备6个EP管，分别编号1、2、3、4、5、6放于管架上，在EP中配制成不同浓度菌液。

1.5.2 菌落计数

将浓度分别为10-1～10-3的乳酸菌涂布在固体培养基中培养。将培养皿放在培养箱中培养，37 ℃下条件下培养12 h。用平板计数法进行菌落计数。

1.5.3 菌落观察

在显微镜下进行，先对其进行直接镜检，再对其进行革兰染色后再镜检。

1.5.4 乳酸菌筛选

从平板中挑选钙溶圈大的菌株在MRS固体培养基上反复纯化筛选。筛选得到乳酸菌，接种到液体培养基中培养。

1.5.5 酸度检验

探究乳酸菌的最适生长pH。OD值可用来表示菌液浓度，而菌液浓度的大小则可以表示乳酸菌生长繁殖的速度。配置pH梯度为3、4、5、6、7、8和9的MRS液体培养液，高压灭菌15 min。按菌液与蒸馏水1∶9的比例配制成10-1浓度的菌液，分别取等量菌液加入不同PH的液体培养基中混匀。置于37 ℃恒温培养箱中培养。测试24 h、48 h后在450 nm条件下测其OD值。

1.5.6 根据盐酸萘乙二胺法测定乳酸菌对亚硝酸盐的降解能力

将筛选出乳酸菌接种于含有适量NaNO2的MRS液体培养基中，同时做空白对照。恒温培养箱中静置培养24 h后检测发酵液中NaNO2的含量。配制对氨基苯磺酸溶液与盐酸萘乙二胺溶液。取上述4瓶培养液，使用国加标准法测定亚硝酸盐含量，用分光光度计于538 nm处测吸光度，每个菌株做3份重复。

2 结果与分析

提取碾碎酱菜上清液，在EP管中配制成不同浓度菌液（见表1），并把其涂布在固体培养基中培养，稀释浓度越高，菌落数量越高（见表2，图1）;进行形态学观察，对其中长势较好的菌落进行镜检（见表3）;革兰染色后乳酸菌被染成了蓝紫色，证明乳酸菌是革兰氏阳性菌（见图2）。从平板中挑选钙溶圈大的菌株在MRS固体培养基上反复纯化筛选，最终挑选钙溶圈最大的3株。将筛选到的菌株编号为LD-1、LD-2、LD-3，接种到液体培养基中，筛选得到乳酸菌。

3 乳酸菌的鉴定

3.1 酸度实验

测试24 h、48 h后乳酸菌在450 nm条件下OD值，发现在48 h的培养周期内，初始pH=6的培养基中乳酸菌一直保持较高的生长性能，繁殖能力最强。结果见表4。

3.2 乳酸菌降解亚硝酸盐实验

用挑选出LD-1、LD-2、LD-3号乳酸菌降解亚硝酸盐，由表5知，与空白对照相比，容量瓶中亚硝酸钠含量均减少，其中1号容量瓶中亚硝酸钠含量最低，证明LD-1乳酸菌对亚硝酸钠分解能力最强。

4 结论

本次实验成功的从酱菜中提取到乳酸菌为革兰氏阳性菌，钙溶圈最大的3株乳酸菌最的适生长pH为6。根据GB/T 5009.33-2008《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的鹽酸萘乙二胺法筛选出了降解亚硝酸盐能力较强的优良乳酸菌株LD-1乳酸菌。从玉堂酱园提供的酱菜中提取到了乳酸菌，证明其生产的酱菜中亚硝酸盐含量可能较低，对人体危害程度较小。将筛选出的LD-1乳酸菌应用到酱菜的生产过程的，可提高酱菜口感风味，并减少亚硝酸盐含量，减少酱菜的腌制时间，提高经济效益。也可将LD-1乳酸菌应用于生产生活中的其他方面，例如酸奶的制作、入药等。

参考文献：

[1]朱军莉，赵 进，朱雅霏.自然发酵蔬菜制品中降解亚硝酸盐乳酸菌的分离与鉴定[J].中国酿造，2015，34（6）：39-42.

[2]黄丽慧，张 雁，陈于陇，等.发酵蔬菜中亚硝酸盐消长规律及调控技术的研究进展[J].食品科学，2013，34（5）：303-307.

[3]刘宗敏，周红丽，谭兴和，等.一株植物乳杆菌的分离鉴定及应用[J].中国酿造，2017，36（7）：95-99.

[4]裴洪丽，姜 韩，闵钟熳.降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选及鉴定[J].中国酿造，2013，32（3）：98-101.

[5]丁娟芳，杨 嘉，朱淑云，等.扬州酱菜中降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选、鉴定及性能研究[J].中国酿造，2018，37（12）：87-91.

[6]张美娜.食品中亚硝酸盐含量测定的影响因素探讨及安全调控[J].粮食科技与经济.2018，43（8）：49-51.