富集自体骨髓间质干细胞在兔椎间关节融合中的应用研究

甘维 朱柔霖 刘雪萍

[摘要] 目的 探討富集自体骨髓间质干细胞在兔椎间关节融合中的应用效果。 方法 选取健康10周龄的新西兰大白兔96只，雌雄不限，随机取新西兰大白兔24只，设为空白对照组（4组）。剩余72只新西兰大白兔均经前路腹膜外行腰椎间盘切除脊柱融合术，建立新西兰大白兔动物模型。建模成功后随机分为1组（n=24）、2组（n=24）、3组（n=24）。1组建模成功后不采取任何措施处理，常规饮食、饮水;2组给予纤维蛋白胶、骨形态发生蛋白干预;3组在2组基础上联合富集自体骨髓间质干细胞移植干预，比较四组大白兔第12周时阶段活动程度、四组大白兔椎体后缘高度丢失情况、椎间关节融合情况、X线侧位片上测量Cobb角情况。 结果 1组关节活动范围与活动度低于2组、3组、4组（P<0.05），2组、3组关节活动范围与活动度相比，无明显差异（P>0.05），4组关节活动范围与活动度最差;四组大白兔椎体后缘高度丢失情况相比，无明显差异（P>0.05）;1组椎间关节融合分级高于2组、3组、4组（P<0.05），2组、3组关节融合分级相比，无明显差异（P>0.05），4组关节融合分级最差;四组大白兔Cobb角相比，无明显差异（P>0.05）。 结论 兔椎间关节融合中，富集自体骨髓间质干细胞移植效果显著，可以有效促进兔椎间关节融合，应在临床上广泛推广与应用。

[关键词] 富集自体骨髓间质干细胞;兔椎间关节融合;骨形态发生蛋白;纤维蛋白胶;椎体后缘高度

[中图分类号] R687.4          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）13-0031-05

[Abstract] Objective To explore the application effect of enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells in the rabbit intervertebral joint fusion. Methods Ninety-six healthy New Zealand rabbits aged 10 weeks were selected of either sex. Twenty-four New Zealand rabbits were randomly selected as the blank control group（group 4）. The remaining 72 New Zealand rabbits were given extraperitoneal lumbar discectomy and spinal fusion via the anterior approach， and the animal model of New Zealand rabbits was established. Those rabbits were randomly divided into group 1（n=24）， group 2（n=24） and group 3（n=24） after modeling. No intervention was given to group 1 after modeling， which was fed with regular diet and drinking water; the intervention of fibrin glue and bone morphogenetic protein was given to group 2; the intervention of enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells was given to group 3 on the basis of group 2. At 12 weeks， the activity level， the loss of height of vertebral posterior margin， the intervertebral joint fusion， and the measured Cobb angle on the lateral X-ray were compared in the four groups. Results The range of joint activity and the activity level in the group 1 were lower than those in group 2， group 3 and group 4（P<0.05）; there was no significant difference in the range of joint activity or the activity level between group 2 and group 3（P>0.05）; the range of joint activity and the activity level in group 4 were lower than those in the other three groups. There was no significant difference in the loss of height of vertebral posterior margin among the four groups（P>0.05）. The grade of the intervertebral joint fusion in the group 1 were higher than those in group 2， group 3 and group 4（P<0.05）; There was no significant difference in the grade of the intervertebral joint fusion between group 2 and group 3（P>0.05）; The grade of the intervertebral joint fusion in group 4 was lower than that in the other three groups. There was no significant difference in the Cobb angle among the four groups（P>0.05）. Conclusion In the rabbit intervertebral joint fusion， the transplantation of enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells has significant effect and can effectively promote the rabbit intervertebral joint fusion， which should be widely popularized and applied in clinical medicine.

[Key words] Enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells; Rabbit intervertebral joint fusion; Bone morphogenetic protein; Fibrin glue; Height of vertebral posterior margin

脊柱融合术在临床上是治疗脊柱畸形、椎体滑脱、脊柱退变性疾病的常用方法。融合材料一般为人工骨、自体骨、异体骨[1]。植入的这些材料体积较大，需要对机体组织进行破坏才能获得较好的手术视野，且术后并发症较多，治疗费用偏高。因此，寻找更加安全、有效、生物活性高的植骨替代材料非常重要。自体髂骨移植是临床上进行脊柱融合的首选方法，但是，有5%～35%的患者会发生单节段脊柱不融合现象，多节段脊柱融合骨不连发生率也非常高，同时，会有30%的患者发生神经损伤、切口感染、血肿、疼痛等症状，这会延长手术时间、增加出血量[2]。有相关研究显示，富集自体骨髓间质干细胞（BMSCs）经过骨形态发生蛋白的诱导可以产生成骨细胞[3]。我院在兔椎间关节融合研究中，使用富集自体骨髓间质干细胞（BMSCs）进行移植，效果显著，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取健康10周龄的新西兰大白兔96只，雌雄不限，随机取新西兰大白兔24只，设为空白对照组（4组）。剩余72只新西兰大白兔均经前路腹膜外行腰椎间盘切除脊柱融合术，建立新西兰大白兔动物模型。建模成功后随机分为1组（n=24）、2组（n=24）、3组（n=24）。新西兰大白兔96只，体重1.5～2.5 kg，平均（1.96±0.22）kg;动物许可证号：SYXK（粤）2019-0201，所选动物均由中山大学医学院动物实验中心提供雄性C57BL/6小鼠常规饲养，自由摄食、饮水，光照12 h，建模前12 h禁食。

1.2 仪器与设备

无菌液态bBMP：广州陆军总院;凝血酶抑肽酶、纤维蛋白原：哈尔滨翰邦公司;胰蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）：美国Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1 骨髓基质干细胞、bBMP、FG复合载体及富集自体骨髓间质干细胞（BMSCs）、FG复合物制备  （1）bBMP、FG复合载体制备。严格无菌条件下将液态bBMP溶液、混合纤维蛋白胶溶液加入纤维蛋白胶抑胰肽酶溶液中聚合而成的FG，最終的bBMP浓度：20 ms/mL，将FG注射到24支无菌离心管内，放置在4℃条件下进行保存[6]。另外再取24支离心管，在其中加入FG，放置在4℃条件下保存。（2）骨髓基质干细胞制备。对选取的每组大白兔各耳朵打孔作为标志，将4 mL骨髓从胫骨粗隆处抽取出来，然后将S液、D-Hank液加入其中混合均匀，将细胞悬液按照1∶1.5的比例进行密度梯度离心[4]。小心的对中间细胞层（富含有核细胞、骨髓基质细胞）吸取，使用D-Hank、S液对细胞进行吹打洗涤，将分离液清除，将细胞液分为3份分别加入含有DMEM的培养液（10 ms/L谷胺酰胺、20%胎牛血清）中进行培养，1周后换溶液，之后定期更换，每3天1次，直到整个培养孔底面铺满贴壁细胞[5]。消化传代过程中将胰酶充分利用起来，同时记录细胞计数。（3）FG、BMSCs复合物制备。在紫外线下放置FG，照射1 h消毒，分别加入各白兔培养的传代3次内的BMSCs悬液，混合，标记[7]。离心细胞，将上清液去除，使其在胶原-bBMP-DMEM和胶原-DMEM混合液中悬浮，调整细胞浓度为5×106/mL[8]。

1.3.2 动物模型建立及方法  （1）新西兰大白兔建模方法。新西兰大白兔96只，雌雄不限，随机取新西兰大白兔24只，设为空白对照组（4组）。剩余72只新西兰大白兔均经前路腹膜外行腰椎间盘切除脊柱融合术，建立新西兰大白兔动物模型，具体建模方法如下：对新西兰大白兔准确称重，给予其静脉注射氯胺酮麻醉，无菌操作下将长度为10 cm的手术切口纵行开在左侧腰大肌前缘，向腹膜进入后钝性分离，将横突充分暴露出来，然后将腹膜、腰大肌推开，方向为沿着横突前方，之后将椎旁肌推开，方向为沿着横突后方，并达到横突根部，将横突咬断，充分暴露L5-6、L4-5、L3-4椎间盘与椎体;用锐刀从侧方切开椎间盘纤维环，将椎间盘前后纤维环保留下来。用刮匙将部分软骨终板、椎间盘刮出，打磨后将软骨终板去除，打磨过程中将梭形小磨钻充分利用起来，将骨性中板充分暴露出来，刮匙辅助下对椎间盘残留髓核、软骨情况进行观察。用椎间盘撑开器将椎间隙撑开，从而建立新西兰大白兔椎间关节融合动物模型。（2）动物干预方法。1组建模成功后不采取任何措施处理，常规饮食、饮水;2组给予纤维蛋白胶、骨形态发生蛋白干预，每盘注射0.08～0.10 mL凝胶，止血完全后缝合切口;3组在2组基础上联合富集自体骨髓间质干细胞移植干预，每盘注射0.08～0.10 mL凝胶，3组、2组新西兰大白兔注射1次即可，止血完全后缝合切口[10]。术后为大白兔注射40万U青霉素，2次/d。连续注射3 d，常规喂食，不限制其活动[11]。

1.4 观察指标

（1）比较四组大白兔第12周时阶段活动程度。（2）比较四组大白兔椎体后缘高度丢失情况。（3）比较四组大白兔椎间关节融合情况，融合情况通过影像学进行评估，采用Lenke字母分级法，骨融合：A级～B级;可疑融合或无融合：C级～D级[12]。（4）比较四组大白兔X线侧位片上测量Cobb角情况，通过X线片检查对Cobb角进行测量[13]。

1.5 统计学方法

采用SPSS21.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验;计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1四组大白兔第12周时阶段活动程度比较

1组关节活动范围与活动度低于2组、3组、4组（P<0.05），2组、3组关节活动范围与活动度相比无明显差异（P>0.05），4组关节活动范围与活动度最差，见表1。

2.2四组大白兔椎体后缘高度丢失情况比较

四组大白兔椎体后缘高度丢失情况比较，无明显差异（P>0.05），见表2。

2.3四组大白兔椎间关节融合情况比较

1组椎间关节融合分级高于2组、3组、4组（P<0.05），2组、3组关节融合分级相比，无明显差异（P>0.05），4组关节融合分级最差，见表3。

2.4 四组大白兔Cobb角情况比较

四组大白兔Cobb角相比，无明显差异（P>0.05），见表4。

3讨论

骨髓间质干细胞属于一种骨髓细胞，具有较多的功能，如自我增殖、多向分化功能等，可以诱导成骨细胞分化与生长。由于该细胞收集比较简单，且培养方法简单便捷，已经在临床上广泛用于骨折与骨缺损重建与修复，同时在脊柱融合中也应用较为广泛[14]。在实际的使用期间需要为骨细胞生长、增殖、分化提供良好前提条件的因子和支架。因此，临床很有必要将合适的生长因子和支架材料寻找出来。

骨形态发生蛋白（bBMP）是一种局部因子，能够为骨组织生长、形成提供良好的前提条件，提取主体为牛骨，该因子的生物作用主要为：（1）募集间充质细胞，对成软骨细胞、成骨细胞分化进行诱导;（2）对其他因子进行诱导，使其在骨形成过程中参与。但是，bBMP需要依赖骨髓基质干细胞、骨系细胞才能将促骨生长作用发挥出来，且成肌细胞、成纤维细胞在BMP的协助下可以转化为骨系细胞[15]。有学者研究发现，将BMP注入到兔椎关节中，可以发现椎间关节融合。还有学者研究发现，将富集自体骨髓间质干细胞移植（BMSCs）、纤维蛋白胶、骨形态发生蛋白结合用于兔椎关节融合中，可以有效促进椎关节融合[16]。本研究显示，1组椎间关节融合分级高于2组、3组、4组（P<0.05），2组、3组关节融合分级相比，无明显差异（P>0.05），4组关节融合分级最差，说明在兔椎间关节融合中，富集自体骨髓间质干细胞移植效果显著，该融合与周围肌肉韧带血供比较丰富有很大的关系。

脊柱融合是临床上治疗脊柱相关疾病的主要方法。自体髂骨移植是临床进行脊柱融合的首选方法，但是很多患者会发生不良的症状。自体骨髓间质干细胞在人体各个部位中的骨髓中均存在，在整个骨髓有核细胞占0.001%～0.01%，一般临床上使用以下方法收集骨髓间质干细胞：（1）免疫磁珠分选法;（2）流式细胞仪分离法;（3）密度梯度离心法;（4）贴壁分离筛选法[17]。免疫磁珠分选法与流式细胞仪分离法对细胞的活性会产生很大的影响，甚至会使细胞活性丧失，且操作方法比较复杂，因此限制了一定的临床使用。贴壁法简单便捷，但是获取细胞的方法比较复杂，细胞的纯度也较差，尤其对于细胞纯度要求高的工作将其作为主要方法是不合适的[18]。密度梯度离心法是当前临床上分离、纯化骨髓间质干细胞的主要方法，该方法效果较好。有相关研究显示，骨髓间质干细胞在体外一定环境下进行诱导、培养可以分化、扩增成骨细胞[19]。最近几年临床上通过富集自体骨髓间质干细胞促进兔椎间关节融合中，获得了较好的效果。而在此过程中应用密度梯度离心法有效提高了细胞的纯化程度[20]。

FG主要形成于凝血反应发生的最后阶段，结合纤维蛋白原凝血酶能够促进纤维蛋白单体的形成，最终聚合三维立体结构FG。FG具有较好的细胞可塑性、相容性，在生物工程载体中较为常用。在对MSCs和FG进行体外复合培养的实验过程中，发现MSCs能够生长于材料表面，同时会逐渐黏附，细胞在不断延长的培养时间下会逐渐长到孔隙中。有学者研究发现，FG可以作为成骨细胞的支架，体外培养后向兔脊柱骨缺损部位植入。术后X线检查、组织学检查发现，有新骨形成于骨缺损部位，同时无炎症反应、排斥反应发生。而新生的骨组织说明FG不会对MSCs的分化与增殖造成影响。

本研究显示，1组关节活动范围与活动度低于2组、3组、4组（P<0.05），2组、3组关节活动范围与活动度相比，无明显差异（P>0.05），4组关节活动范围与活动度最差，这就说明，在兔椎间关节融合中，富集自体骨髓间质干细胞移植效果显著，可以更好地促进兔椎间关节活动范围与活动度恢复，兔椎间关节融合效果显著。

本研究显示，四组大白兔椎体后缘高度丢失情况相比，无明显差异（P>0.05），四组大白兔Cobb角相比，无明显差异（P>0.05），说明在兔椎间关节融合中，富集自体骨髓间质干细胞移植对于椎体后缘高度、Cobb角的影響较小，与纤维蛋白胶、骨形态发生蛋白的效果相比，无明显差异，但是，富集自体骨髓间质干细胞移植在促进兔椎间关节活动情况与融合中发挥重要的作用。

综上所述，兔椎间关节融合中，富集自体骨髓间质干细胞移植效果显著，可以有效促进兔椎间关节融合，促进兔椎间关节活动范围与活动度恢复，因此，应在临床上广泛推广应用。

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（收稿日期：2019-10-23）