家蝇幼虫抗菌蛋白对小鼠烫伤创面愈合的影响

谢治梅 刘流 贺莉芳

[摘要] 目的 研究家蝇抗菌蛋白对小鼠皮肤烫伤模型创伤愈合的影响。 方法 将 36只健康成年小鼠随机分为生理盐水组、磺胺嘧啶银组和抗菌蛋白组，制备皮肤烫伤模型，将供试品按 0.2 mL/只的剂量涂抹创面上，1 次/d。于损伤后第7、14、21天测量皮肤损伤面积，计算伤口愈合率，同时用免疫组化试剂盒常规方法测BFGF、EGF含量。第21天取损伤部位皮肤，组织切片观察其形态学变化。 结果 第21天抗菌蛋白组和磺胺嘧啶银组小鼠皮肤损伤部位愈合率均值分别为93.15% 和91.79%，与生理盐水组均值71.32%比较，提高了21.83%和20.47%（P<0.05）; 组织形态学显示，21 d时抗菌蛋白组皮肤组织已完全愈合，对照组尚未完全愈合。抗菌蛋白组BFGF及EGF表达在14、21 d明显超过对照组，差异有显著性（P<0.05）。 结论 家蝇抗菌蛋白能改善小鼠烫伤部位肉芽组织生长状态，可能是通过促进BFGF、EGF的表达，从而促进创面的修复过程。

[关键词] 抗菌蛋白;烫伤创面;表皮生长因子（EGF）;碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）

[中图分类号] R737.33          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）13-0027-04

[Abstract] Objective To study the effect of antibacterial protein from Musca domestica larvae on wound healing in mouse skin scald model. Methods 36 healthy adult mice were randomly divided into normal saline control group，topical sulfadiazine silver group，and Musca domestica larvae antibacterial protein group. The skin scald model was prepared. The test product was applied to the wound surface at a dose of 0.2 mL/mouse，once a day. The skin injury area was measured on day 7，14，and 21 after injury，and the wound healing rate was calculated. At the same time， the contents of BFGF and EGF were measured by conventional methods of Y immunohistochemistry kit. On the 21st day，the skin of the injured site was taken，and the morphological changes were observed in tissue sections. Results On the 21st day， the average healing rates of skin burn in mice in the antibacterial protein group and the silver sulfadiazine group were 93.15% and 91.79%，respectively，which were 21.83% and 20.47% higher than the mean of 71.32% in the normal saline control group（P<0.05）. Histomorphology showed that the skin tissue of the antibacterial protein group had completely healed on the 21st day， while the control group had not completely healed. The expressions of BFGF and EGF in the antibacterial protein from Musca domestica group were significantly higher than those in the control group on day 14 and 21，and the differences were significant（P<0.05）. Conclusion Antibacterial protein from Musca domestica larvae can improve the growth state of granulation tissue in burns of mice，which may promote the repair process of wounds by promoting the expression of BFGF and EGF.

[Key words] Antibacterial protein; Scald wound; Epidermal growth factor（EGF）; Basic fibroblast growth factor（BFGF）

近年來，研究认为抗菌蛋白通过影响细胞膜的结构和功能，起到抑菌、杀菌作用[1]。抗菌蛋白能够抗细菌、真菌、寄生虫，一些研究还发现，其还能杀伤病毒甚至多种肿瘤细胞[2-4]。家蝇体内外抗菌活性物质的研究也受到人们广泛关注，其中研究较多的是抗菌蛋白[5]。家蝇抗菌蛋白因其分子量小，且受温度影响小、水溶性好、无免疫原性等特点，具有广谱的生物活性。但目前家蝇幼虫抗菌蛋白的研究主要集中在对抗菌蛋白诱导和分离纯化，以及体外试验分析抑菌特性等方面，其作为药物的体内实验研究并不多[6]。研究者发现在创伤后，抗菌蛋白可能作为一种影响创伤愈合的细胞信号分子，参与创伤后上皮重建[7，8]，但其机制尚不明确。表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）加速细胞分裂，促进增殖，增加细胞迁移，而碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，BFGF）作为一种生长因子，可调控靶细胞的生长、增殖与分化，进而实现创伤的快速修复，二者可促进皮肤屏障修复[9，10]。为探索抗菌蛋白在模型小鼠烧伤创面愈合中所起的作用及其可能机制，尤其是对表皮生长因子（EGF）及碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）表达的影响，本实验以家蝇3日龄幼虫为原料，金黄色葡萄球菌诱导家蝇幼虫产生抗菌活性物质，研究家蝇抗菌蛋白对小鼠烫伤创面愈合率、EGF和BFGF表达的影响，探讨家蝇抗菌蛋白促进创面愈合的可能机制，旨在研究其对组织修复的促进作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 虫源  家蝇幼虫由贵州医科大学寄生虫学教研室吴建伟教授惠赠，参考文献[11，12]饲养;抗菌物质的提取：参照文献[13]提取抗菌蛋白;图像处理：IMS图像分析系统Q550CW（基尔顿生物科技有限公司，上海）进行图像信号采集与系统分析处理。

1.1.2 动物  本研究所使用的小鼠（动物许可证号：GB14925-95），SPF级，6～8周大，36只雌雄各半，体重18～22 g，购于厦门大学东南附属医院中心实验室，符合中国实验动物标准。所有操作均按照厦门大学东南附属医院中心实验室要求及规范执行。

1.1.3 试剂  10%水合氯醛，硫化钠，抗菌蛋白（25 mg/L），磺胺嘧啶银（10 mg/L），生理盐水（30 mg/L）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组与设计  36只小鼠，雌雄各半，随机分成生理盐水组、磺胺嘧啶银组、抗菌蛋白组，每组12只。

1.2.2 深Ⅱ度烫伤模型的建立  腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠[14]，俯卧固定于搪瓷盘内，用10%硫化钠除去背部毛。烧开清水，使用温度计测得实时温度为95℃，将电烙铁置于水中保持沸腾30 min后，迅速取出电烙铁无压力置于小鼠背部，反复2～3次。烫伤后创面苍白、肿胀，病理证实为深Ⅱ度烫伤。

1.2.3 创面处理  烫伤模型建立后，分别用生理盐水、 磺胺嘧啶银、家蝇抗菌蛋白涂抹于相应组小鼠的创口处，自然暴露创口，每天定时用药 1 次，每次0.2 mL。

1.3观察指标

1.3.1 创面愈合率测定  术后在3、7、14、21 d用直尺测量创面横长（r1）和纵长（r2），根据椭圆面积公式计算创面面积，愈合率=（原创面积-测量时面积）/原创面积×100%[15，16]。

1.3.2 创面组织观察  创伤后第21天取创面组织，用10%甲醛固定后行苏木素-伊红（HE）染色，显微镜下观察创面组织。

1.3.3 BFGF含量、EGF含量的检测  术后7、14、21 d每组分别处死小鼠3只，按免疫组化试剂盒常规方法测BFGF含量、EGF含量。图像分析BFGF、EGF以细胞黄染为阳性。从每张免疫组化染色切片中随机选取5个视野，输入Q550CW图像信号采集与分析系统测量阳性细胞的平均灰度值，以反映伤口局部BFGF、EGF的表达量，平均灰度值越大，BFGF、EGF表达量越小，二者关系呈反比[17]。采集分析样本创面部位，通过显微镜拍照采集图像与分析，计算阳性面积。

1.4统计学分析

采用SPSS 26.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，采用方差分析对多个样本均数进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 用药后三组小鼠创面愈合率的比较

第3天时，三组间无显著性差异，7、14、21 d时抗菌蛋白组、磺胺嘧啶银组与生理盐水组比较创面愈合率有显著性差异（P<0.05），21 d时抗菌蛋白组的愈合率达到93.15%，生理盐水组仅为71.32%。14、21 d时抗菌蛋白组与磺胺嘧啶银组愈合率比较无显著性差异。见表1。

2.2 三组小鼠皮肤组织的病理学观察

生理盐水组：可见组织充血水肿，出血，组织疏松，表皮缺失，大量坏死，可见較多炎性细胞、肉芽组织，表明皮肤尚未愈合;磺胺嘧啶银组：组织内仍有少量炎性细胞、纤维细胞、老化肉芽，表明皮肤组织基本愈合;抗菌蛋白组：组织内肉芽不多，大部分形成胶原，未见炎性细胞，血管分布少，表明皮肤组织已完全愈合。见封三图6。

2.3 用药后三组小鼠创面BFGF、EGF灰度值比较

EGF、BFGF以细胞黄染为阳性，阳性细胞的平均灰度值越小，其表达量越高。与生理盐水组相比，磺胺嘧啶银组和抗菌蛋白组BFGF在7 d时表达增高不明显，在14 d、21 d时表达明显增高，差异有显著性（P<0.05）。抗菌蛋白组与磺胺嘧啶银组在7 d、14 d、21 d时，BFGF表达无明显差异（P>0.05）。磺胺嘧啶银组和抗菌蛋白组BFGF的总体灰度值低于生理盐水组，即BFGF的总体表达高于生理盐水组，差异有显著性（P<0.05）;磺胺嘧啶银组和抗菌蛋白组的EGF在7 d时表达增高不显著，14 d时表达明显增高，与生理盐水组相比有明显差异（P<0.05），21 d时EGF又回归到生理盐水组水平。磺胺嘧啶银组和抗菌蛋白组EGF的总体灰度值低于生理盐水组，即EGF总体表达高于生理盐水组，差异有显著性（P<0.05）。见表2。

3 讨论

烫伤组织愈合过程非常复杂，是由修复细胞、炎细胞、细胞因子、细胞外基质相互作用完成的[18]。研究表明巨噬细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞合成内源性 EGF和BFGF等，参与损伤部位的增殖和创面修复[19，20]。EGF可以加速上皮的再生，促进胶原蛋白合成，且有刺激血管生成等作用[21]。BFGF通过对细胞增殖与分化的促进作用，实现了对于各种创伤的快速修复[22]。一些研究发现抗菌蛋白通过提高EGF来促进上皮细胞增殖[23，24]。家蝇抗菌肽不仅具有抗多种病原及杀伤肿瘤的优势，其抑菌效果甚至优于传统抗生素，且不产生耐药性[1]。家蝇抗菌蛋白与抗生素相比，其抗菌谱广且不易损伤人体正常细胞，作用机制也与抗生素大不相同。由于烫伤导致皮肤屏障功能被破坏，极易导致创面感染，而创面感染又是影响其愈合的主要原因之一。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌是烫伤感染中主要的致病菌，其在自然环境中分布广泛，且对抗生素易产生耐药性[25]。因此在目前开发新型抗生素非常困难的情况下，探寻家蝇抗菌蛋白在组织创伤修复中的作用及其抗菌效果，开发其成为新型肽类抗生素的巨大潜能[26]。

本次实验构建小鼠深Ⅱ度烫伤模型，建立了生理盐水组、磺胺嘧啶银组和抗菌蛋白组，对各组创面愈合率及组织形态学，以及EGF、BFGF的表达进行研究，探寻家蝇抗菌蛋白对组织修复的影响和机制。已知磺胺嘧啶银是一种抗菌药，对大多数革兰阳性菌和革兰阴性菌皆有抑菌活性，同时具有收敛作用，使创面干燥易结痂，可促使创面提前愈合。结果显示，3 d时磺胺嘧啶银组和抗菌蛋白组创面修复能力与生理盐水组均无明显差异，7、14、21 d时磺胺嘧啶银组和抗菌蛋白组的创面愈合能力比生理盐水组显著增强，第7天时，抗菌蛋白组与磺胺嘧啶银组有显著差异，且在7 d、14 d、21 d时，抗菌蛋白组小鼠皮肤愈合率均值均高于磺胺嘧啶银组，结果证明，磺胺嘧啶银和家蝇抗菌蛋白具有促进创面修复的能力，缩短了模型小鼠烫伤后创面愈合时间，且从结果中还发现家蝇抗菌蛋白促进小鼠皮肤烫伤愈合效果与磺胺嘧啶银效果相当甚至更佳。21 d时进行皮肤组织的病理学观察，发现抗菌蛋白组皮肤组织已完全愈合，较生理盐水组愈合更好，较磺胺嘧啶银组愈合也稍好。本实验结果发现，抗菌蛋白组和磺胺嘧啶银组碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）的表达在伤后14 d、21 d时明显高于生理盐水组，表皮生长因子（EGF）的表达在14 d时明显高于生理盐水组，抗菌蛋白组的BFGF、EGF表达稍高于磺胺嘧啶银组，提示抗菌蛋白对BFGF的合成和分泌有促进作用。同时，结果还显示抗菌蛋白组创面愈合率的提高在时间上与EGF、BFGF表达增高趋势基本一致。根据实验数据，可以推测此结果很可能与抗菌蛋白分子促进EGF、BFGF分泌有关。

综上所述，家蝇抗菌蛋白促进了模型小鼠烫伤创面的愈合，并对控制创面感染有一定作用。抗菌蛋白可能通过促进EGF、BFGF的分泌加快了组织修复，显著加速了创面愈合，缩短了愈合时间。家蝇抗菌蛋白因其抗菌谱广、抗菌效果好，且无耐药性等优点，可能具有开发成为新型肽类抗生素的潜能。

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（收稿日期：2020-03-03）