右美托咪定预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤及自噬的影响

胡朝勇,郭永清

(1山西医科大学麻醉学院山西省人民医院麻醉教研室,太原 030001;2山西医科大学附属人民医院麻醉科;*通讯作者,E-mail:gyq106968@aliyun. com)

急性脑梗死是临床常见的脑血管疾病,致残率及致死率均较高,虽然近年来溶栓治疗手段不断进步,但缺血脑组织在溶栓过程中发生血流再灌注可加重组织损伤,即缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤[1,2]。脑I/R损伤的可能机制包括炎症反应、氧化应激、自噬、凋亡等,其中自噬是受到越来越多关注的机制之一[3,4]。已有研究表明,脑I/R过程中细胞自噬加剧,这可能是脑组织在缺血缺氧及I/R条件下自我保护的代偿机制之一[5];多种具有神经保护功能的药物能够在脑I/R损伤过程中激活自噬,这可能是不同药物发挥神经保护功能的分子机制[6-8]。因此,调节自噬也被认为是减轻脑I/R损伤的重要靶点。

右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是临床广泛使用的镇静镇痛药物,多用于全麻辅助和ICU镇静,通过高选择性激活α2肾上腺素能受体发挥作用。Dex预处理能够减轻脑I/R损伤及I/R局部的炎症反应,但Dex在脑I/R损伤过程中对细胞自噬的调控作用尚不明确。因此,本实验将以脑I/R损伤大鼠为对象,探讨Dex对大鼠脑I/R损伤及自噬的影响,旨在进一步明确Dex在脑I/R损伤过程中的保护作用及相应的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠购自山西医科大学动物中心,8-10周龄、150-180 g,生产许可证:许可证号 SCXK(晋)2019-0004;饲养环境为12 h/12 h的光/暗周期、湿度55%-65%、温度20-24 ℃,自由摄食饮水。

1.2 主要试剂及仪器

右美托咪定(江苏恒瑞公司)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)购自美国Sigma公司,Beclin-1, LC3、p-AMPK的抗体购自英国Abcam公司。正置显微镜购自日本尼康公司,透射电镜购自日本日立公司,凝胶成像系统购自上海勤翔公司。

1.3 动物分组、造模及给药

SD大鼠随机分为对照组、I/R组和Dex组,每组12只。对照组进行假手术操作,分离一侧颈动脉,不做其他干预;I/R组在造模前30 min腹腔注射0.25 ml生理盐水;Dex组在造模前30 min,腹腔注射0.5 ml/kg右美托咪定生理盐水稀释至0.25 ml。I/R组和Dex组采用线栓法建立脑I/R模型,腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉,做颈正中切口后分离一侧颈总动脉,切开并向头端置入一预先用酒精灯烧成圆头的肝素浸泡过的尼龙丝线栓,感到有阻力后停止,保留线栓90 min,而后取出,完成造模、缝合切口。

1.4 神经功能评分

再灌注24 h时,按照Longa等[9]研究中的神经功能评分进行评价,具体标准见表1。

表1 神经功能评分标准

Table 1 Standard of neurological function score

评分 标准0分无神经功能缺损症状1分缺血对侧前爪屈曲2分行走时向对侧旋转3分行走时向对侧倾倒4分意识丧失

1.5 脑梗死面积的TTC染色检测

再灌注24 h时,每组随机选择6只大鼠,麻醉状态下断头处死后取脑组织,-20 ℃冰冻20 min,而后沿冠状面切成每片厚度2 mm的脑片,共5片,在2%TTC溶液中避光孵育30 min,而后在10%多聚甲醛溶液中固定,数码相机拍照记录,用ImageJ软件计算5张切片中的梗死面积,按照公式(A1+A2+A3+A4+A5)/(S1+S2+S3+S4+S5)×100%计算脑梗死面积,A1-A5为每一片的脑梗死面积，S1-S5为每一片的脑组织总面积。

1.6 自噬小体检测

再灌注24 h时,每组随机选择6只大鼠,断头法处死后取缺血脑组织、约1 mm3,在2.5%戊二醛溶液中固定并保存,检测时用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗组织块3次,放入1%锇酸中、4 ℃固定1 h,70%、80%、95%、100%乙醇溶液梯度脱水后环氧树脂包埋,-80 ℃聚合24 h,制作60-70 nm厚度的切片并用3%柠檬酸铅染色,最后在透射电镜下观察,随机选择10个细胞并对细胞内的自噬小体进行计数。

1.7 Western blot检测Beclin-1、LC3、p-AMPK表达

取1.6中6只大鼠剩余的缺血脑组织,加入RIPA裂解液并匀浆,匀浆液12 000 r/min,离心10 min,分离上清后测定蛋白含量,取30 μg蛋白样本进行Western blot检测,在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,而后电转移至NC膜,NC膜在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h,放入1 ∶1 000稀释的Beclin-1、LC3、p-AMPK、AMPK抗体中4 ℃孵育过夜;加1 ∶2 000稀释的辣根过氧化物酶二抗,室温孵育1 h,在凝胶成像系统中曝光得到蛋白条带,根据蛋白条带的灰度值计算蛋白表达量。

1.8 统计学分析

采用SPSS22.0软件录入数据,计量资料以均数±标准差表示，三组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Dex对I/R大鼠神经功能评分的影响

与对照组比较,I/R组的神经功能评分明显增加(P<0.05);与I/R组比较,Dex组大鼠的神经功能评分明显降低(P<0.05,见图1)。

2.2 Dex对I/R大鼠脑梗死面积的影响

与对照组比较,I/R组的脑梗死面积明显增加(P<0.05);与I/R组比较,Dex组大鼠的脑梗死面积明显缩小(P<0.05,见图2)。

与对照组比较,*P<0.05;与I/R比较,#P<0.05图1 三组大鼠神经功能评分的比较Figure 1 Comparison of neurological function among three groups

与对照组比较,*P<0.05;与I/R比较,#P<0.05图2 三组大鼠脑梗死体面积的比较Figure 2 Comparison of cerebral infarction volume among three groups

2.3 Dex对I/R大鼠缺血脑组织中自噬小体形成的影响

与对照组比较,I/R组大鼠缺血脑组织中自噬小体形成增多;与I/R组比较,Dex组大鼠缺血脑组织中自噬小体形成进一步增多(见图3)。

黄色箭头所指为自噬小体;与对照组比较,*P<0.05;与I/R比较,#P<0.05图3 三组大鼠缺血脑组织中的自噬小体Figure 3 Autophagy bodies in ischemic brain tissues after different treatment

2.4 Dex对I/R大鼠缺血脑组织中自噬标志基因表达的影响

与对照组比较,I/R组大鼠缺血脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达明显上调(P<0.05);与I/R组比较,Dex组大鼠缺血脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达显著上调(P<0.05,见图4)。

与对照组比较,*P<0.05;与I/R比较,#P<0.05图4 三组大鼠缺血脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达量的比较Figure 4 Comparison of Beclin-1, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ expression in ischemic brain tissues among three groups

2.5 Dex对大鼠缺血脑组织中自噬信号通路激活的影响

与对照组比较,I/R组大鼠缺血脑组织中p-AMPK的表达水平明显增加(P<0.05);与I/R组比较,Dex组大鼠缺血脑组织中p-AMPK的表达水平明显增加(P<0.05，见图5)。

与对照组比较,*P<0.05;与I/R比较,#P<0.05图5 三组大鼠缺血脑组织中p-AMPK表达量的比较Figure 5 Comparison of p-AMPK expression in ischemic brain tissues among three groups

3 讨论

器官组织缺血后恢复血液灌注,缺血性损伤进一步加重的现象,称为缺血-再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤时对脑组织造成损伤的主要因素,不是缺血本身,而是恢复血液供应后过量的自由基生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等[3,4]。临床上颈动脉内膜剥脱术、心脏体外循环、器官移植、心肺复苏、神经外科介入手术、感染等都可能发生脑缺血后再灌注损伤。由于大脑对缺氧和缺血极其敏感,围手术期脑缺血再灌注损伤可能成为术后恢复延迟、术后谵妄和术后认知功能障碍和死亡的重要危险因素之一,因此围术期脑保护是保障患者术后良好康复的重要措施。

研究显示,右美托咪定(Dex)通过激活 PI3K/Akt 途径,抑制细胞凋亡,阻止casepase-3 级联反应而发挥神经保护作用。陈萌等[6]、Zhang等[7]、Ahsan等[8]在脑I/R损伤中使用具有神经保护作用的药物干预并观察到细胞自噬被激活,提示激活自噬是神经保护药物减轻脑I/R损伤的机制。Dex减少缺血缺氧性损伤,发挥脑保护作用,Chi等[10]通过动物实验证实,出血时使用右美托咪定可减少局部的脑血流量(CBF)和脑代谢率(CMR),保持脑氧供需平衡状态,发挥神经保护作用。颅脑外伤患者围手术期给予右美托咪定镇静有利于脑组织的氧供需平衡或促进受损组织的血液灌注[11]。研究显示，Dex对脑缺血再灌注损伤大鼠认知功能及神经功能具有保护作用[12]。全麻手术老年患者应用右美托咪定可减轻术后认知功能障碍,机制可能与降低线粒体膜电位,减少线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性损伤有关[13]。右美托咪定抑制N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体过度激活,减少兴奋性氨基酸的释放,降低兴奋性氨基酸毒性[14],Dex可抑制 NF-κB 的激活,降低 TNF-α、IL-6 水平,减轻脂多糖诱导的大鼠海马区神经损伤[15];Dex预处理可抑制线粒体凋亡通路,抑制细胞内钙超载,减轻神经元的氧化应激损伤[16],调节凋亡和自噬。本实验结果显示,I/R大鼠的神经功能评分明显增加,脑组织TTC染色后显示明显的脑梗死病灶,Dex预处理后大鼠的神经功能评分降低、脑梗死体积均较I/R大鼠明显减少,提示Dex对大鼠脑I/R损伤具有保护作用。

自噬是近年来发现在脑I/R损伤过程中起保护作用的生物学环节,细胞内各种基质及细胞器通过溶酶体系统降解,是保证细胞在各种压力环境下存活的重要生物学环节。脑I/R损伤过程中,自噬的激活是机体自我保护的代偿机制,能够平衡细胞合成和分解代谢,为缺血缺氧的细胞供能并在一定程度上减轻I/R损伤。在缺血缺氧等应激状态下自噬作为机体的一种防御机制,通过适时清除损伤及老化的细胞器,维持细胞内环境的稳定以及细胞的正常生长。缺血再灌注损伤时,线粒体产生的活性氧爆发以及线粒体通透性的改变均可诱发自噬,而自噬对于维持细胞线粒体的功能也扮演着重要的角色。有研究在脊髓、肺、肠缺血再灌注动物模型中观察到Dex能激活自噬减轻组织缺血再灌注损伤[17-19]。

AMPK通路是目前已知调控细胞自噬的关键信号通路,信号分子AMPK能够感受细胞外能量变化并调控能量代谢;AMPK磷酸化激活不仅对缺血缺氧、I/R等损伤具有保护作用,也能在缺血缺氧、I/R过程中激活自噬[20-22]。本实验结果显示,右美托咪定预处理后大鼠缺血脑组织中自噬小体形成增加、自噬标志基因Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达上调、自噬信号通路p-AMPK激活,提示Dex预处理能激活大鼠脑I/R损伤过程中的自噬和AMPK通路。自噬的激活可能是脑组织自我保护的代偿机制,也可能是Dex减轻脑I/R损伤、脑保护作用的机制之一。

综上所述,Dex预处理能减轻大鼠脑I/R损伤并促进自噬,激活AMPK通路是可能的分子机制,但AMPK在Dex减轻脑I/R损伤并促进自噬中的直接作用仍有待进一步研究证实。