江西省部分地区鸭圆环病毒的检测与分子特点

杨行，韩瑞，张文波，殷贵虎，唐云云

(江西农业大学动物科学技术学院，江西 南昌 330045)

鸭作为主要家禽之一，是我国传统和特色养殖业的重要组成部分。随着国内外市场需求旺盛，鸭养殖量和规模不断增加，引种和交易频繁，从业人员素质参差不齐，使疫病带来的经济损失风险也愈加明显。如何科学防控疫病、降低风险是目前养鸭业面临的重要问题。

圆环病毒病是一种危害巨大的免疫抑制疾病，可感染多种动物，主要导致动物机体免疫系统损失，并引起严重的继发感染，给养殖业造成了严重的经济损失[1]。圆环病毒是无囊膜的单股DNA病毒。鸭圆环病毒(duck circovirus, DuCV)由德国学者HATTERMANN等[2]在2003年首次报道，是目前已知感染鸭最小的病毒，目前仍无人工培养成功的报道。基因组与分子遗传学研究表明，DuCV可分为2 个基因型：DuCV-1、DuCV-2，核苷酸序列相似性低于92%，编码氨基酸相似性低于73%，其致病力差异明显，DuCV-1 是国内主要的致病基因型[3-5]。鸭圆环病毒病(duck circovirus disease，DCVD)是由DuCV引起鸭的一种慢性消耗性和免疫抑制性传染病，主要表现为鸭体生长不良、鸭体器官萎缩以及继发严重的细菌感染，给鸭场造成严重经济损失[6]。国内外多次报道此病，也进行了大量的研究，但DuCV致病机制仍不清楚，也无商品化的疫苗，因此了解该病的流行情况、病毒的分子特点等，对科学防控该病有着重要的实际意义。

江西省是国内重要的养鸭区域之一，是省内部分地区重要的产业，老病未除、新病不断发生，给养鸭业造成极大的损失。关于黄病毒病、鸭腺病毒感染等报道较多，但对DuCV的流行情况和分子特点报道较少。本试验对江西省养鸭集中的部分地区的8个规模化养鸭场病死鸭的DuCV分子流行情况进行初步调查，并对核苷酸序列进行系统进化树及相似性分析，初步了解DuCV的分子流行情况和毒株基因型，丰富了江西地区DCVD流行病学资料，对江西地区鸭圆环病毒病等鸭病防控具有一定的参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

江西省3个地区(抚州、九江、宜春)内8个养殖规模较大的鸭场的病死鸭，无菌采集肝脏、肺脏和法氏囊共42份， -80 ℃保存。

1.1.2 试剂

病毒基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)；DNA 2000 Maker(全式金生物科技有限公司)；2× FastTaqPreMix(tolobio)。

1.1.3 引物合成

根据GenBank上登录的DuCV全基因组序列和文献[7]进行设计：DuCV-F：5′-TTA CRG GCG MTT GTM CTC- 3′，DuCV-R：5′-TAM TTG RTT TCM GCG GXA- 3′，扩增片段大小605 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 组织DNA提取

参照病毒基因组DNA抽提试剂盒说明书进行操作。

1.2.2 PCR

以提取的病毒DNA为模板，PCR反应体系为25μL：2×FastTaqPreMix 12.5μL，上下游引物各0.5μL， dd H2O 10.5μL；PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸25 s，35个循环；最后72 ℃ 8 min。PCR产物经1%琼脂凝胶电泳检测。

1.2.3 序列测定

5个阳性检出鸭场各选择1份阳性PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.2.4 序列分析及进化树绘制

在线BLSAT比对分析所测序列，利用MEGA 10和DNAstar软件分析所测序列与已发表DUCV相应序列的相似性，并绘制系统进化树。参考的序列信息见下表(表1)。

表1 文章所用序列信息表

名称登录号基因型来源年份D12MR021KC851823.1DuCV-1韩国2014AQ0901GU014543.DuCV-1南京2009GX180511MK814578.1DuCV-1广东2019GX190510MK814581.1DuCV-1广西2019JSPX03EMF627688.1DuCV-1山东2018WF0803GU131342.1DuCV-1山东2009DU095HM162349.1DuCV-1北京201133753-52DQ100076.1DuCV-1美国2007DUCVAY228555DuCV-1德国2003FC35/2012KC460527.1DuCV-1广西2014NN13/2012KC460532.1DuCV-1广西2014GX190512MK814583.1DuCV-1广东2019YN190415MK814589.1DuCV-1广东2019SDLY0201MF627690.1DuCV-1山东2018TC1/2002AY394721.1DuCV-2台湾2006YN180505MK814584.1DuCV-2云南2019WS-GD01FJ554673.1DuCV-2广东2009DUCV-FuJian-2011KF726087.1DuCV-2福建2011GX1104JX241046.1DuCV-2广西2011GD190401MK814575.1DuCV-2广东201911-1KF941310.1DuCV-2广东2014

2 结果

2.1 DuCV的PCR检测

将提取的病毒DNA进行PCR，扩增产物经1%琼脂凝胶电泳。结果，部分样品在约600bp处有明显的条带，与预期大小基本一致(图1)。8家规模化鸭场，5个场有阳性样品检出；采集的42份样品，18份为阳性样品，阳性率为42.9%(表2)。

M.DL2000 DNA Marker；1，2.阴性样品；3～8.阳性样品；9，10.阴性样品

图1 部分样品DuCV的 PCR检测结果

表2 8个规模化鸭场的DuCV感染情况

养殖场12345678总计病料数5442838842检出数3430305018阳性率/%6010075037.5062.5042.9

2.2 序列测定与分析

送检5份样品进行序列测定。结果，序列长度均为605 bp (分别命名为：JX-DuCV1，JX-DuCV2，JX-DuCV3，JX-DuCV4，JX-DuCV5)，BLAST比对分析，所测序列与GenBank上登录的DuCV-1相应序列的相似性均在95%以上，而与DuCV-2相应序列的相似性均在85%～89%之间。

2.3 相似性及系统进化分析

系统进化树结果显示，5株DuCV均属于DuCV-1型，其中JX-DuCV2、JX-DuCV4与DuCV 1b亚型位于同一进化分支，JX-DuCV1、JX-DuCV3和JX-DuCV5与DuCV 1a亚型位于同一进化分支(图2)。

图2 DuCV部分序列系统进化树分析

核苷酸相似性分析，5株DuCV基因片段核苷酸序列之间的相似性均在97%以上，且与参考的DuCV-1型相应核苷酸序列相似性均在95%以上，与参考的DuCV-2型核苷酸序列相似性均低于90%，见图3。

图3 DuCV部分核苷酸相似性分析

将所测的序列与GenBank中登录的DuCV-1型和DuCV-2型相应序列进行比对分析。结果， DuCV-1型和2型间有多个核苷酸位点不一致；所测序列中JX-DuCV4的25位核苷酸和38位核苷酸与DuCV-2型一致，43位与DuCV-2型均缺失1个核苷酸A，其他位点均与DuCV-1型的位点一致；其他所测的4条序列均与DuCV-1型的位点变异一致(表3)。

表3 所测DuCV序列片段、DuCV-1型、DuCV-2型相应序列的突变位点分析

核苷酸位点DuCV-1DuCV-2JX-DuCV4核苷酸位点DuCV-1DuCV-2JX-DuCV425缺AA363TG28GA365TG32AT366CG37CG367CT38TGG382TC39TAG383GC40AG385TG41GC410AC43C缺C412GC44A缺433GC55GT436GT61CT

3 讨论

2003年HATTERMANN等[2]首次报道鸭圆环病毒病及DuCV，2006年CHEN等在中国台湾检测到该病毒[8]，随后在山东、广西、浙江、广东等省也陆续报道了该病[9-12]。DuCV可感染各种日龄及各种品种的鸭，感染后可导致免疫抑制，鸭群单独感染DuCV后死亡率不高[13]，但易引起细菌和病毒性疾病的继发感染而导致死亡率升高。粟裕琼等[14]对DuCV阳性样品进行多种疾病的检测，发现DUCV单独感染仅占18.42%，多重感染占81.58%。DuCV对养鸭业危害较大，且常以隐性感染存在，容易被忽视，造成严重损失，因此，在生产过程中需对DuCV加强关注。

DuCV是一种新发现的病毒，其研究还不深入，目前没有合适的体外培养体系；其诊断方法包括血清学检测方法及病原学检测方法，其中PCR具有较强的敏感性、易操作，且成本较低，适合分子流行病学调查。本试验中，通过对江西省8个规模化鸭场的病死鸭样品进行DuCV的PCR检测，结果，42份样品中有18份阳性样品检出，总阳性率为42.9%，且8个养殖场中有5个鸭场有阳性样品检出，表明江西省规模养鸭场的圆环病毒阳性场比率较高，且病死鸭中的检出率达到42.9%，应引起养鸭场的足够重视。孙文超[15]对云南及广西鸭圆环病毒检测阳性率为5%；屈素洁等[16]对广西3个市DuCV检测阳性率为18%。本试验结果表明，江西地区DuCV阳性率要高于其他省份的研究报道，说明DuCV在江西地区流行较为广泛。

根据核苷酸序列差异，可将DuCV分为DuCV-1型和DuCV-2型，DuCV-1型又可分为1a、1b和1c 3个亚型[17]；DuCV-1型和DuCV-2型在多个核苷酸位点存在差异。本课题组前期对DuCV-1型和DuCV-2型的全基因组进行比对分析发现，在DuCV基因组的5′端非编码区和相邻的部分ORF1片段(605 bp)，变异性较大，用该片段构建系统进化树与用全基因组构建的进化分析树基本一致，故本试验选择该片段进行DuCV的检测靶标和分析。

本试验对5家阳性场各随机选择1份阳性PCR产物进行测序，并将测序结果构建基因系统进化树及核苷酸相似性分析。5株DuCV均为DuCV-1型，JX-DuCV2与JX-DuCV4属于1b亚型，JX-DuCV1、JX-DuCV3和JX-DuCV5属于1a亚型；核苷酸序列相似性分析显示，5株DuCV相似性均在97%以上，与DuCV-2型相似性均在90%以下。结果表明，江西省内鸭场DuCV以DuCV-1型流行为主，且分为2个亚型，与国内其他研究报道有一定差异。李志国[18]、王鑫[19]均检测出了明显的DuCV-1与DuCV-2共感染，这可能与采样数量及地区差异有关。

本试验在剖检病死鸭过程中，发现部分鸭存在明显的细菌继发感染，导致用药效果不佳，表明DuCV可能是某些细菌感染或病毒性疾病暴发的诱因。因目前尚无预防鸭圆环病毒病的疫苗，且流行程度较高，所以在养鸭过程中必须加强对DuCV的重视度，加强种鸭、种蛋、孵化、养殖等过程中的饲养管理及对各种疾病的科学防控，避免DuCV感染导致其他疾病暴发，减少经济损失。