蒙古国科布多省牛新孢子虫病PCR诊断初报

吾力江，道尔加拉，郝蕴伟，刚特穆尔，马钰，巴音查汗*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.蒙古国科布多大学，科布多，布音特 84000)

犬新孢子虫(Neosporacaninum)是导致牛流产、死产的主要原因之一，在牛群养殖业中引起严重的疾病和经济损失[1]。每年因新孢子虫引起牛流产造成的经济损失超过12.983亿美元，最高可达到 23.80亿美元，其中 2/3 的损失由乳制品行业产生，约为 8.429亿美元[2-3]。新孢子虫的感染在很多国家都有报道，然而在蒙古国从未报道。2010年，玄学南等[4]报道过蒙古羊弓形虫的ELISA检测，并未报道检出新孢子虫。蒙古国科布多省与新疆青河接壤，两国之间密切的贸易往来也可能是导致疾病传播的原因之一。据了解，科布多省母畜流产率呈上升趋势。为调查科布多省母畜流产是否与新孢子虫的感染有关，对新孢子虫病确诊及确定病原种类尤为重要。中国新疆与蒙古国科布多省在“一带一路”和“上合组织成员国家”长期稳定的合作关系的背景下，中国新疆将草食家畜流产症防控实践中成功、成熟的相关技术推广到蒙古国西部省区草食家畜“母畜流产症”上。因此，本研究采用PCR诊断方法，对科布多省部分试验点牛群进行新孢子虫的初步检测。

1 材料与方法

1.1 样本收集

2019年1～4月，先后在科布多省2个试验点进行分阶段蹲点采集，在布音特苏木乡、艾尔登特苏木乡、明戈特苏木牧场等3个检测点共采集120份牛血样；所有牛血样均在EDTA抗凝管中采集，样品被送往寄生虫实验室，并在-20 ℃下储存直到分析。

1.2 试剂与主要仪器

赛百盛树脂型TM基因组DNA提纯试剂盒购自鼎国昌盛生物技术有限公司，胶回收试剂盒购自美国OMEGA公司，2×TaqPCR Green Mix、DL2000Marker、pMD18-T载体均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3 引物合成

在生工生物技术(上海)有限公司合成了《新孢子虫检疫技术规范》(SN/P 3499-2013)中规定的NC-5基因引物，具体反应条件和引物序列见表1。

表1 PCR引物及反应条件

引物序列片段大小(bp)退火温度(℃)循环条件SN/T 3499FSN/T3499RGGGTGAACCGAGGGAATTCGCCAGTCAACCTACG2315895 ℃/30 s,58 ℃/30 s,72 ℃/30 s,30个循环

1.4 血液基因组DNA提取、扩增及测序

用赛百盛树脂型TM基因组 DNA提纯试剂盒提取牛全血 DNA，放置于-20 ℃冰箱。以提取的DNA为模板进行目的基因扩增，PCR反应体系 50 μL：2×EsTaqMaster Mix 25 μL，上、下游引物各 2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。扩增产物取5 μL 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。用胶回收试剂盒回收纯化PCR 产物，连接pMD18-T 载体上，转化到 DH5ɑ 大肠杆菌感受态细胞中，将转化后的菌液涂布在含氨苄青霉素(100 mg/L)的培养基上培养。次日挑取单个菌落，提取质粒；委托生工生物技术(上海)有限公司进行测序，测序结果在NCBI上经BLAST比对确定产物扩增结果，MEGA 6.0软件做多重比较并构建系统发育树。计算序列间的相似度。从GenBank中下载相关序列(表2)，以Eimeriatenella为外类群，用邻近法构建NJ树[5]。

表2 来自Genbank的相关基因序列

种名宿主来源登录号序列长度/bp洪氏新孢子虫(N.hughesi)马美国CF937166.1531美国CB831689.1636美国CB831693.1484美国CB831816.1620美国CB831888.1373美国CD667672.1424美国CF350036.1510美国CF937166.1531犬新孢子虫(N.caninum)奶牛波兰EF463098.1336奶牛新西兰AY459289.1350裸鼠瑞士X84238.11205兔英国EU686398.1227绵羊英国DQ077663.1227柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)鸡美国BI895222.1477

2 结果

2.1 新孢子虫NC-5基因PCR扩增

对所提取的120份牛血样DNA 进行了PCR检测，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳30 min后，得到231 bp的特异性目的片段(图1)，与预期结果相符。120份样品中，9份呈阳性，总感染率为7.5%(9/120)；布因特苏木乡感染率为2.8%(1/35)；明戈特苏木牧场感染率为3.3%(1/30)；艾尔登特苏木乡感染率为12.7%(7/55)，在3个检测点里感染率最高。

2.2 序列分析

PCR扩增牛血样DNA，NC-5序列长度为231 bp，与预期目的片段长度相符。经测序和DNAMAN比对，去除两端部分可变碱基后，获得了226个碱基；本试验所得到的新孢子虫序列(N.caninumWLJ)与新孢子虫(GenBank登录号：EF463098.1、AY459289.1、X84238.1、EU686398.1、DQ077663.1)的序列碱基相似度高达99.05%(图2)。

注：M.DL2000 DNA分子质量标准；1.被检样品；2.阴性对照

图1 PCR扩增结果

注：深蓝代表碱基全部相同、浅蓝代表碱基1/2相同，红色代表碱基3/4相同。

图2 NC-5序列同源性比较

2.3 新孢子虫NC-5 基因系统发育分析

基于NC-5序列的NJ树(图3)显示，系统发育树中新孢子虫属分为两大支，其中，N.hughesi单独聚为一支，N.caninum聚为一支，置信度为91%。系统发育分析表明，NC-5与GenBank 上下载的EU686398.1 构成一个自展值为99% 的拓扑结构分支。

3 讨论

科布多省位于蒙古西南边疆，东面与扎布汗省和戈壁阿尔泰省相接，北面与乌布苏省相连，西面与巴彦乌列盖省为邻，南面和西南面同我国新疆维吾尔自治区接壤。新疆是连通欧亚大陆的重要枢纽，是第二座“亚欧大陆桥”的必经之地，是与“一带一路”沿线国家进行贸易往来的重要门户。蒙古国科布多省与中国新疆接壤，据调查发现，蒙古国与中国新疆接壤处常常有母畜流产发生。欧洲[7]、亚洲[8]、蒙古国以南的俄罗斯报道了衣原体导致的山羊流产[9]，而蒙古国以北的中国新疆报道了新孢子虫导致的牛羊流产情况[10-11]。蒙古国对新孢子虫病的研究仍处于空白。蒙古国是畜牧业大国，代代以草原畜牧业为主，依靠草原畜牧业提供的肉、乳等畜产品；蒙古国的牛群饲养量约为488.28万头，位居绵羊数量之后第二位，牛群出现频繁流产导致养牛业经济迅速下降。因此，本研究通过新孢子虫病的PCR检测，探究科布多省牛群流产是否与新孢子虫的感染有关。

图3 基于NC-5基因序列构建的邻接法(NJ)系统发育树

采用PCR方法，针对新孢子虫NC-5基因检测对血液、脑组织内虫体敏感性较好，故作为本试验的诊断引物。本试验对随机采集的120份牛血DNA进行新孢子虫的PCR检测，新孢子虫阳性率为7.5%(9/120)，确定了牛群中新孢子虫的存在。经测序，科布多省牛新孢子虫NC-5株与GenBank上的英国株、瑞士株、新西兰株同源性达99%，其序列相似性为95.13%，有个别碱基的差异，因此推测它们之间存在一定的进化关系。

蒙古国科布多省牛群以散养为主，牧民家里饲养牧羊犬，这可能是导致新孢子虫感染牛群的原因。因此减少病原体传播是防控牛流产的最有效的方法之一。

本文初次报道科布多省牛群感染新孢子虫，填补了蒙古国新孢子虫研究的空白，为后续新孢子虫病的防控研究提供了基础资料。