GC-O和GC-MS结合鉴定金银花精油中的特征香气组分

林德洪，陈 中，张 伟，胡 武，卢真保

(1.华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州 510641；2.广州华芳烟用香精有限公司，广东 广州 510530)

金银花(Honeysuckle)，正名为忍冬(品种来源：LonicerajaponicaThunb.)，如图1。“金银花”一词在《苏沈良方》中最早出现，且对其形状特征进行描述，其花初开呈白色，其后变黄。其属于忍冬属植物初开的花。在中药领域，金银花有重要的价值，也是药食两用的食材[1-3]。在我国，金银花的种植区域集中在山东、陕西、河南、河北、湖北、江西、广东等地。

图1 金银花

挥发油是存在于植物体中的一类在常温下可挥发的具有芳香气味的油状液体总称。在香料行业，把挥发油分成两类：精油和净油。精油是指用水蒸气蒸馏法、压榨法、冷磨法、干馏法、超临界萃取、分子蒸馏法从香原料植物器官(如花、叶、枝、籽等)中所制得的含香物质的制品。净油是指用有机溶剂萃取香料植物器官和其渗出物(树脂、树胶、香膏)，除去所用的溶剂而得到的香料制品[4]。金银花香气浓郁，是清幽型花香香韵，香气丰富。其挥发油香韵丰富、特征鲜明。

有关金银花的挥发油成分鉴定多采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)。如林凯[5]采用同时蒸馏萃取法提取福建金银花挥发油，用GC-MS法分析鉴定；景延秋[6]等采用GC-MS法，研究了金银花中挥发性及半挥发性成分的种类及含量；孙胜南[7]等用水对金银花进行提取，用大孔树脂进行分离水提物，采用GC-MS法分析鉴定金银花分离物，鉴定出38种成分。彭莲[8]等应用电子鼻技术与高效液相分析金银花，研究金银花气味与化学成分之间的相关性。

二十一世纪以来，成分鉴定技术快速发展。气相色谱-嗅觉测量法，简称GC-O法，嗅香师嗅闻从被测物分解出的成分的气味，结合谱图成分分析推断、鉴别出相对应的花合物，并对气味特征进行描述评价。GC-O可以鉴别出检测物的具有独特气味的挥发性成分和不同浓度下各气味成分对被测物整体香味的影响程度；在特征香味、香味活性化合物等成分鉴定方面具有明显的优势。Lasekanetal.[9]使用GC-O技术的稀释法，从多个苹果品种鉴别出45个香气活性物质，使用多元统计分析PLS法得出10个关键香气成分，关键成分主要为对伞花烃、苯甲酸甲酯、己酸甲酯以及乙酸乙酯等。Kraujalyteetal.[10]基于DF法对沙果果汁所含有的香气活性成分进行分析，分析鉴定出沙果香气的主要贡献物来自于己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸甲酯以及壬醛等。然而，金银花挥发油活性香气成分系统分析及加香评价应用研究鲜见报道。

本实验采用GC-MS结合GC-O技术，分析鉴定金银花精油的特征香气组分，建立金银花精油香气组分分析研究方法，探索其在烟草行业的应用价值，旨在为金银花在香料行业应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器设备

材料：金银花为广东省梅州市种植，采购自广州市清平药材市场，见图2。未加香加料烟丝叶组，广东中烟工业公司提供。

试剂：石油醚(沸点 60～90℃)，广州溶剂厂；乙醚(色谱纯)，广州溶剂厂；乙醇为分析纯，蒸馏水。

仪器设备：流水式中药粉碎机，温州鼎历医疗器械厂；电热鼓风恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；加热回流萃取装置，广州泽明仪器有限公司；HA-100-0.5型超临界CO2萃取装置，江苏华安科研仪器有限公司；NVP-1000隔膜真空泵，CCA-1112A冷冻循环水机，N-1300旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社；GC7890B-MS5977A气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；ODP2嗅觉测量仪，德国GERSTEL公司。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理

将无破损的金银花放入烘箱，在50℃下烘5 h，再使用流水式粉碎机粉碎成粉末，并通过80目的筛网进行筛分。

1.2.2 金银花挥发油制备

石油醚萃取法。称取100 g金银干花粉于2 L烧瓶内，按料液质量比1∶12加入石油醚，在萃取时间3 h、萃取温度45℃条件下浸提；过滤取滤液，旋转蒸干，得到金银花净油，称取质量。实验重复3次，取平均值；记录提油量。

超临界CO2萃取法。取100 g金银干花粉，应用超临界二氧化碳萃取设备，设定萃取压力25 MPa，萃取温度40℃，CO2流量为20 L/h，分离压力6 MPa，分离温度50℃。进行超临界萃取，收集分离釜的金银花精油，称重。每次实验重复3次，计算平均提油量。

1.2.3 卷烟加香感官评吸

按照烟草行业标准，使用金银花挥发油进行加香实验，并运用感官评价法对样品进行评价。

设定好添加比例，将称量好的金银花净油和金银花精油分别以70%乙醇稀释，分别喷加于未加香加料的烟丝叶组上。将两组烟叶分别卷成卷烟，放入恒温恒湿箱中放置48 h以达到平衡。存放参数设置为：相对湿度(60±2)℃，温度(22±1)℃；然后，进行感官评价。

1.2.4 金银花精油的成分检测

对超临界萃取法制备的金银花精油进行GC-MS和GC-O成分检测。

1.2.4.1 金银花精油GC-MS分析

色谱柱：HP-INNOWAX毛细管色谱柱19091N-133i(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：250℃；进样量：1 μL，分流比：50∶1；程序升温：初温40℃，保持1 min，然后以1℃/min升至150℃保持5 min，再以5℃/min到250℃保持10 min；载气为高纯He，流速1.0 mL/min；传输线温度：260℃；四极杆温度：150℃；EI电离能量：70 eV；离子源温度：230℃；扫描方式为全扫描，质量扫描范围30～650 amu；溶剂不延迟。

1.2.4.2 金银花精油GC-O分析

以乙醚为溶剂，按1∶3、1∶9、1∶27、1∶81、1∶243比例对金银花精油进行逐步梯度稀释，并采用GC-O技术对金银花精油溶液，进行了稀释嗅闻分析。

取稀释液1 μL，注入嗅觉仪分析。一直到评价员在嗅辨器上无法嗅辨出香味，溶液稀释停止。当样品中的香气成分未被嗅辨出时，每种香气活性物质的香气贡献用所需的最小稀释因子(稀释因子)表示。每种香味成分的稀释因子(FD)是对应的最高稀释倍数。

2 结果与分析

2.1 金银花挥发油卷烟加香评吸

2种方法提取的金银花挥发油。金银花净油呈浅黄绿色，金银花精油呈淡黄色，均澄清透明，无明显刺激性，具有金银花特有香味。金银花精油具有自然清新的花香，清甜香较明显，并伴有较轻青滋感、酸香；嗅闻香味较金银花净油的甜润感更足，清香突出。

通过感官评价，判定金银花挥发油添加香烟评吸差别(见表1)。按照烟草行业评价规定，由烟草评吸小组，分别对添加了金银花挥发油的卷烟样品进行盲评，记录分值。

在卷烟中加入质量比为0.001%和0.005%的金银花挥发油，均表现出掩盖烟草原有的香气。添加0.001%挥发油，能增加卷烟香气量，突出清甜花香；和空白对照烟比较，甜香、果香和药草香有轻微增加；能有效掩盖杂气，提高烟气丰富性；金银花精油能谐调卷烟烟香，细腻飘逸烟气。同种类的金银花挥发油样品，添加低用量(0.001%)的评价总分高于添加高用量(0.005%)的样品；添加比例较高的样品有着较好的增香性、丰富性、清雅度；高比例条件下的金银花精油，与卷烟的一致性和协调性更高。添加低比例的挥发油的样品中，超临界萃取的金银花精油的评分最高。金银花精油较净油更好地提升了烟气自然清新感、甜润感。2种金银花挥发油，超临界法金银花精油更适合用于卷烟加香(见表1和表2)。

2.2 金银花精油成分GC-MS分析

成分检测数据见图3和表3。从金银花精油中共分离出68种化合物，主要由醇类44.48%、烯类16.49%、酸类12.73%、醛类7.88%、酯类6.53%、酮类4.10%等组成；它们的峰面积和共占金银花精油成分总面积的92.21%；此外，还有少量微量化合物。在鉴定出的成分中，芳樟醇比例最高，占比是10.91%，其次是2-十三醇6.98%，1-二十二烯6.42%，二十九烯5.74%，棕榈酸4.41%，羟基香茅醛4.30%等。

图3 金银花精油GC-MS总离子流色谱图

表3 金银花精油的挥发性成分

表3(续)

表3(续)

2.3 金银花精油香气成分GC-O鉴定

在金银花精油挥发性成分中，通过嗅辨仪鉴定到香气物质57种(见表4)。金银花精油整体香气特征为清香、花香感较重，果香感也比较明显，并伴有蜜甜香、轻微茴香和酸香。苯乙酸乙酯、苯乙醇、芳樟醇、羟基香茅醛、异戊酸香叶酯、苯甲醛、二氢芳樟醇、香兰素、壬酸烯丙酯和氧化石竹烯的FD因子较大，都能达到81以上，说明它们可以在浓度极低情况下散发出强烈的香气，对金银花精油香味影响较大。香气强度最大的物质有2种，分别为苯乙醇和羟基香茅醛，稀释因子均为729，它们是对金银花精油香味贡献最大的物质。而且，这些组分的香味阈值都很低，苯乙醇的阈值低至0.004～0.007 mg/kg。阈值是指人们通过嗅觉能辨别某种香味时的最低嗅出浓度。一般来说，一个香料的阈值越小，其香气强度越大。这些组分的阈值低、稀释因子大，也证明了它们是金银花精油的重要香气组分。

嗅香师经过反复闻香，结合谱图分析和香味物质强度，最终确定了金银花精油的特征香味物质为5种，它们分别为苯乙醇、异戊酸香叶酯、羟基香茅醛、芳樟醇和壬酸烯丙酯。

金银花精油整体香气特征为清香、花香感较重，果香感也比较明显，并伴有蜜甜香、茴香和轻微酸香。而这5种金银花精油的特征香味组分，其中羟基香茅醛、芳樟醇均带有青香，主要为清新感的香气，与整体香气特征清香相一致；壬酸烯丙酯、异戊酸香叶酯以果甜为主，与整体香气特征的果香感较一致；苯乙醇具有蜜甜花香，是玫瑰花油的主要成分之一，是配制玫瑰香精和茉莉等花香型香精的“必用成分”；与金银花整体香气特征花香、蜜甜香相一致。因此5种金银花精油的特征香味成分均与金银花精油整体香气相协调，是构成金银花精油整体香韵的主要贡献组分。

金银花精油整体香气特征为清香、花香感较重，果香感也比较明显，并伴有蜜甜香、茴香和轻微酸香。而清香、甜香、辛香和果香这些香韵都是卷烟加香上重要的香韵特征，添加在卷烟上，金银花精油的功能显著，能起到协调烟香，提升烟气的清甜香和果香，并且增加甜润感，使烟气清雅细腻。金银花精油特征香味组分中，羟基香茅醛、芳樟醇氧化物赋予卷烟清新的香气，提升烟气细腻度；壬酸烯丙酯、异戊酸香叶酯以果甜为主，增加卷烟的润甜感、改善余味；苯乙醇具有蜜甜花香，与烟气协调，提升烟气飘逸感。由此，将金银花精油添加在卷烟商，能够与烟气协调，增加了卷烟香气量，突出清香，花香、果香和蜜甜香有轻微增加；提高了烟气丰富度，并能有效将杂气掩盖。

表4 金银花精油香气组分的香气强度

表4(续)

3 结论与讨论

采用2种方法提取金银花挥发油；添加在卷烟中，金银花挥发油均有提高卷烟的清甜花香感、细腻烟气、提高烟气丰富性等作用。其中，金银花精油的评分最高，更好地提升了烟气自然清新感、甜润感。对金银花精油进行GC-MS成分检测，共检测出70种化合物；其中，环氧芳樟醇比例最高，占比是10.07%。GC-O法检测分析表明，苯乙醇(蜜甜花香)、异戊酸香叶酯(果甜香)、羟基香茅醛(青香)、芳樟醇(花青香)和壬酸烯丙酯(果香)，是金银花精油的特征香味组分。

对香气特征组分的综合分析表明，金银花精油在卷烟加香上具有很好的应用价值。通过对金银花精油GC-O和GC-MS的综合分析，确定了金银花精油的特征香气及其成分基础，建立了一套完整的金银花精油香气分析研究方法，分析和确定其精油的特殊信息，如香气阈值，特征香气组分等，并研究了金银花精油在卷烟中的应用。对于分析金银花精油的香味性能，了解金银花精油的香味成分以及每种香味成分对整体香气特性的贡献，以及对金银花香料制品在香料行业的进一步应用具有重要的参考意义。