苯并咪唑酮类衍生物的合成及生物活性的初步研究
2020-07-13刘褚雯刘进兵
刘褚雯，易 灿，刘进兵
(邵阳学院 食品与化学工程学院，湖南 邵阳 422000)
酪氨酸酶(EC 1.14.18.1,Tyrosinase)是一种含有铜离子的多酚氧化酶，广泛分布于自然界中[1-2]。由于其具有独特的双重催化作用，是人体内黑色素形成的关键酶，黑色素的过度合成及分泌会导致多重疾病的产生，如人体皮肤色素障碍性疾病、帕金森等[3-4]。另外在农业生产中，大量的蔬菜和水果由于黑色素分泌过多而褐变被丢弃[5-6]。而目前已经上市的酪氨酸酶抑制剂如曲酸、熊果苷、氢琨等存在较大的副作用，已无法完全满足当前的需求, 需要进一步开发高效低毒的药物来满足社会的需要[7-11]。
苯并咪唑类化合物是一类具有多种生物活性且结构比较简单的氮杂环类化合物，被广泛用于农药、医药等领域[12-16]。另外本课题组前期研究发现席夫碱类化合物具有很好的酪氨酸酶抑制活性[17-18]，因此依据生物活性叠加原理，我们设计了该系列化合物(图1), 将5-氨基苯并咪唑酮与醛两部分拼合，以期发现高效低毒的酪氨酸酶抑制剂及抗肿瘤药物。
图1 苯并咪唑酮类衍生物的合成
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
WPX-4显微熔点仪；UV -1780紫外可见分光光度计；Bruker Ascend(400M)型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；美国 Biotek 公司酶标仪。
醛、5-氨基苯并咪唑酮和冰乙酸均购置于上海达瑞试剂有限公司，酪氨酸酶购置于Sigma-Aldrich公司；A549人肺癌细胞、HepG2人肝癌细胞及MCF-7人乳腺癌细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库；RPMI-1640 培养基(Thermo公司)；胎牛血清(Hy-clone公司)；CCK-8试剂及二甲基亚砜(Amresco公司)；其他试剂均为市售分析纯，未进一步纯化处理。
1.2 2a～2h的合成通法[17]
将(10 mmol)5-氨基苯并咪唑酮和12 mmol 1a～1h分别加入到圆底烧瓶中，再加入20 mL无水乙醇，搅拌下缓慢滴加3滴冰乙酸，升温至回流状态后保温反应，TLC跟踪反应。待反应完成，冷却至室温后置于冰箱中静置，析出大量固体，抽滤，冷的乙醇洗涤，粗产品经95%乙醇重结晶，晾干得中间产物2a～2h。
2a：黄色固体，收率90.2%；1HNMR(DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73(s，1H，-OH)，δ10.73(s，1H，-NH)，δ10.0(s，1H，-NH)，δ10.15(s，1H，-OH)，8.75(s，1H，=CH)，7.39～7.37(d，J = 8.3Hz，1H，Ph-H)，6.94～6.93(d，J = 5.7 Hz，3H，Ph-H)，6.37～6.25(m，2H，Ph-H)；13CNMR(DMSO-d6，75 MHz)，δ 163.3，162.4，160.8，156.1，141.9，134.5，131.0，129.0，114.9，112.6，109.3，108.1，102.8，101.2。
2b：淡黄色固体，收率91.2%；1HNMR(DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73(s，1H，-OH)，δ10.62(s，2H，-NH)，8.84(s，1H，=CH)，7.97(s，1H，Ph-H)，7.49～7.45(m，1H，Ph-H)，7.14～7.11(m，1H，Ph-H)，7.01(s，1H，Ph-H)，6.92～6.83(m，3H，Ph-H)，3.87(s，3H，-OCH3)；13CNMR(DMSO-d6，75 MHz)，δ 159.5，156.0，153.4，145.8，133.1，130.9，127.0，124.6，121.0，114.9，112.3，109.2，101.4，56.2。
2c：黄色固体，收率92%；1HNMR(DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73 (s，1H，-OH)，δ10.58 (s，2H，-NH)，8.71(s，1H，=CH)，7.94～7.91(d，J = 8.5 Hz,1H，Ph-H)，6.90～6.88(d，J = 8.1 Hz，1H，Ph-H)，6.82～6.77(m，2H，Ph-H)，6.64～6.61(m，2H，Ph-H)，3.86(s，3H，-OCH3)，3.85(s，3H，-OCH3)；13CNMR (DMSO-d6，75 MHz)，δ 163.6，160.8，155.9，152.8，146.1，130.7，128.3，117.6，114.5，109.0，106.7，101.2，98.4，56.1，55.8。
2d：淡黄色固体，收率91.1%℃；1HNMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73(s，1H，-OH)，δ10.67(s，2H，-NH)，8.75(s，1H，=CH)，8.08～8.05(m，1H，Ph-H)，7.75～7.52(m，1H，Ph-H)，7.34～7.29(m，2H，Ph-H)，6.998～6.92(m，3H，Ph-H)；13CNMR(DMSO-d6，75 MHz)，δ 163.5，161.0，155.9，150.6，144.8，133.3，130.7，127.8，125.1，124.0，116.5，115.2，109.0，101.5。
2e：棕色固体，收率40.2%；1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ 10.72(s，1H)，10.68(s，1H)，8.64(s，1H)，7.99～7.84(m，2H)，7.58～7.45(m，3H)，6.98～6.85(m，3H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 158.67，156.27，145.32，137.05，131.66，131.10，129.43，129.23，129.07，115.39，109.34，101.80。
2f：橙色固体，收率70.2%；1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ 13.56(bs，1H)，10.80(bs，2H)，8.95(s，1H)，7.21(d，1H，J=7.5 Hz)，7.12～6.84(m，5H)，3.81(s，3H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 161.69，156.27，151.15，148.57，141.68，131.30，129.92，124.49，120.06，119.12,116.91，115.71，109.50，101.67，56.59.。
2g：黄色固体，收率80.2%；1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ 14.59(s，1H)，10.83(bs，2H)，9.07(s，1H)，7.14～7.22(m，2H)，7.10～7.07(m，2H)，7.12～6.96(m，2H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 163.01，160.03，156.19，140.84，134.63，131.41，130.53，126.16，124.10，117.80，117.48，116.00，109.68，101.67。
2h：黄色固体，收率82.2%；1H NMR ((DMSO-d6，300 MHz)，δ 13.84(s，1H)，11.27(s，1H)，11.21(s，1H)，9.36(s，1H)，8.27(s，1H)，7.93(d，1H，J=8.7 Hz)，7.39(d，1H，J=8.7 Hz)，7.51～7.32 (m，3H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 159.95，156.27，141.50，135.56，134.57，131.30，130.21，122.02，119.62，116.17，110.44，109.51，101.55，31.39。
1.3 抑制酪氨酸活性测试
采用本课题组通用的酪氨酸酶抑制活性测试方法进行[17]。
1.4 细胞培养及增殖情况检测[19]
A549细胞接种于细胞培养皿，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640( Roswell Park Memorial Institute-1640)完全培养基，37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。
用CCK8法检测细胞增殖情况，取对数生长期A549细胞、HepG2细胞及MCF-7细胞，以2×104cell·mL-1的浓度接种于96孔板，待细胞贴壁后，在各孔加入不同浓度(1，2，4，8，16，32，64，128，256，512，1024 ng·mL-1)的化合物2a-2j，空白对照组未加入药物，阳性对照组加入5-氟尿嘧啶，计算2a-2j及5-氟尿嘧啶的IC50值。
2 结果与讨论
2.1 合成部分
本文通过实验合成了8个苯并咪唑类类衍生物，其收率在40.2%～92.0%之间。其中无取代的苯甲醛收率最低，为40.2%。当苯甲醛2号及4号位上被甲氧基取代时收率最高，为92.0%。由此初步推测，苯甲醛上取代基的存在提高了反应活性。
2.2 酪氨酸酶抑制活性
参照文献，检测所有化合物对酪氨酸酶的抑制活性，结果见表1。
表1 化合物2a～2h对酪氨酸酶抑制活性
如表1 所示，化合物2a与化合物2f具有一定的酪氨酸酶抑制活性，通过SPSS Statistics 17.0计算化合物2a和化合物2f的IC50值分别为(120.25 ± 1.06)μM和(111.17 ± 0.86)μM，与阳性对照药物熊果苷(IC50值(102.11± 1.12)μM)相当，其他化合物的抑制酪氨酸酶活性效果都不如阳性对照药物熊果苷，说明苯环上羟基取代可能有利于提高抑制活性，甲氧基取代基位置改变或甲氧基数目增加对抑制活性不利，这可能与甲氧基的共轭效应以及位阻效应有关。
2.3 抗肿瘤活性
表2 化合物2a～2h抗肿瘤活性
分别考察了所合成的8个化合物对A549人肺癌细胞、HepG2 人肝癌细胞及MCF-7 人乳腺癌细胞的抑制作用，结果见表2。从表2可以发现，所有化合物对A549人肺癌细胞和HepG2 人肝癌细胞均没有明显的抑制作用，除化合物2d外，对MCF-7 人乳腺癌细胞也没有明显的抑制作用。
3 结论
本文合成了8个苯并咪唑衍生物，并考察了所有目标化合物抑制酪氨酸酶活性及抗肿瘤效果。其中化合物2f抑制酪氨酸酶活性效果最好，其IC50值为(111.17 ± 0.86) μM，与阳性对照药物熊果苷抑制活性相当；初步构效关系分析表明，羟基的位置和羟基的数目对抑制酪氨酸酶活性效果有一定的影响；另外该系列化合物对除2d对MCF-7人乳腺癌细胞有明显抑制作用外，其他化合物对A549人肺癌细胞、HepG2 人肝癌细胞及MCF-7 人乳腺癌细胞均没有明显的抑制作用。这些研究成果为后续深入开展工作提供了重要参考。
