新型苯并咪唑类化合物对辣椒根腐病菌毒力的测定

何佳佳 韩新才 何 瑶 彭 俊 韦瑞旺 巨修炼

（武汉工程大学环境生态与生物工程学院， 武汉 430205）

辣椒是我国种植面积最多的蔬菜作物，也是经济价值最高的蔬菜作物，近年来种植面积在133.33万hm2（2 000 万亩）以上[1]。然而，辣椒的病害问题依然严峻。

根腐病是影响田间辣椒作物产量的最严重的病害之一，由真菌引起，其中最主要的就是腐皮镰孢菌（Fusarium solani）[2]，此类微生物病菌在土壤里存活10 年甚至更久。部分地区由于此类微生物病菌的危害，辣椒减产20%～30%，严重时达50%以上甚至绝产[3-4]。腐皮镰孢菌引起的根腐病大大降低了田间作物辣椒的产量，现辣椒根腐病已经成为我国辣椒生产和作物经济可持续发展的限制性因素之一。

苯并咪唑是制备具有杀菌活性农药的中间体，其衍生物低毒、抗菌、抗癌、抗寄生虫等，具有非常广谱的活性，在化学、医学以及农业领域都得到了广泛关注[5-6]。20 世纪80 年代以来，苯并咪唑类杀菌剂得到广泛的使用，在农业上可防治多种真菌病害，如大多数子囊菌、半知菌和担子菌等引起的病害，效果非常显著[7]。

随着原有的苯并咪唑类杀菌剂使用时间的延长,土壤残留危害越来越严重，病害菌的抗性变得越来越强,导致杀菌剂的活性持续降低, 甚至在一些地区丧失了杀菌能力[8-9]。因此，有必要研发出具有发展潜力的新型农药来解决当下问题。

本研究通过测定12 种新型苯并咪唑类化合物对辣椒根腐病菌—腐皮镰孢菌（Fusarium solani）的抑菌活力和毒力，探究其是否对腐皮镰孢菌具有杀菌潜力，为辣椒根腐病新型杀菌剂的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试药剂

12 种新型苯并咪唑类化合物[10]，分析纯，名称及结构见表1，由武汉工程大学巨修炼教授团队化合物合成。

丙酮、分析纯、助溶剂，用于溶解新型苯并咪唑类化合物。

1.2 供试菌株

辣椒根腐病菌—腐皮镰孢菌（Fusarium solani），由武汉农业科学院蔬菜所提供。

1.3 培养基

PSA 培养基，配方：土豆200 g、蔗糖20 g、琼脂粉18 g、水1 000 mL。

1.4 含药培养基制备的方法

称取0.02 g 化合物于烧杯中，无菌条件下取5 mL 丙酮至烧杯中溶解，加5 mL 无菌水，从而获得2 000 μg/mL 的母液；迅速移至微小管，标记。取1 mL 母液至培养皿中，加入9 mL 配制好的PAS 培养液，冷却凝固待用。

1.5 抑菌率的测定

在含200 μg/mL 新型苯并咪唑类化合物的PSA 培养基上，接种同一菌龄且直径为5 mm 的辣椒根腐病菌菌饼，重复3 次，于28 ℃恒温培养箱中培养5 d 左右，当对照菌落快长满培养皿时，用十字交叉法测量菌落直径，取平均值，分别计算12 种新型苯并咪唑类化合物的菌丝抑菌率。

表1 新型苯并咪唑类化合物名称结构

1.5 EC50 值的测定

初筛后，对抑菌率最大的3 种新型苯并咪唑类化合物进行毒力回归分析。用丙酮溶解一定量待测化合物，加等量水获得一定浓度母液，再稀释成5个不同浓度，获得试验所需浓度梯度，分别测定其抑菌率。以待测化合物浓度数值为自变量X，以菌丝抑菌率机率值为因变量Y，利用SPSS 软件计算出毒力回归方程和相关系数R，根据回归方程求出EC50值。以EC50值的大小评定新化合物的生物活性与毒力大小，确定杀菌效果最好的化合物。

2 结果与分析

2.1 新型苯并咪唑类化合物对辣椒根腐病菌的抑菌效果

12 种新型苯并咪唑类化合物浓度都为200 μg/mL 时，测定其对辣椒根腐病菌抑菌率，结果见表2。

表2 结果表明，12 种新型苯并咪唑类化合物对辣椒根腐病菌均有一定的抑菌活性，抑菌率为46.56% ～83.96%，编号对应化合物抑菌率分别为：D7e 83.96%、D7k 79.62%、D7i 77.25%、D7g 75.83%、D7f 75.47%、D7h 75.12%、D7b 74.21%、D7j 72.60%、D7a 72.15%、D7c 61.64%、D7d 54.48%、D7l 46.60%。抑菌率大小顺序：D7e ＞D7k ＞D7i ＞D7g ＞D7f ＞D7h ＞D7b ＞D7j ＞D7a ＞D7c ＞D7d ＞ D7l。其中，抑菌率最高的3 个化合物为N-(3- 氯苄基 )-1H- 苯并咪唑（编号D7e）、N-(3,5- 二氯苄基 )-1H- 苯并咪唑（编号D7k）和N-(3,4- 二氯苄基 )-1H- 苯并咪唑（编号D7i），其抑菌率分别为83.96%、79.62%和77.25%；抑菌率最低的化合物是N-(2,4-二羟基苄基)-1H-苯并咪唑（编号D7l）,其抑菌率仅为46.60%。

表2 12 种新型苯并咪唑类化合物对辣椒根腐病菌的抑菌效果

从结构上看，苯并咪唑类化合物中取代基不同，其抑菌效果具有明显差异。

（1）苯并咪唑类化合物中，含卤族取代基的化合物抑菌效果最好。其中，3-氯取代物抑菌率最高，如N-(3- 氯苄基 )-1H- 苯并咪唑的抑菌率达83.96%；3-溴取代物次之，如N-(3-溴苄基)-1H-苯并咪唑的抑菌率为75.83%；4-氟取代物最差，如N-(4-氟苄基)-1H-苯并咪唑的抑菌率为54.48%。

（2）苯并咪唑类化合物中，含甲基取代基的化合物抑菌效果一般，如N-(3-甲基苄基)- 1H-苯并咪唑和N-(4-甲基苄基)-1H-苯并咪唑，其抑菌率分别为72.15%和74.21%。

（3）苯并咪唑类化合物中，2,4 二羟基取代化合物抑菌活性最低，如N-(2,4-二羟基苄基)-1H-苯并咪唑,其抑菌率仅为46.60%。

2.2 目标化合物对辣椒根腐病菌的毒力回归分析

N-(3- 氯苄基 )-1H- 苯并咪唑（编号D7e）、N-(3,5- 二氯苄基 )-1H- 苯并咪唑（编号D7k）和N-(3,4- 二氯苄基 )-1H- 苯并咪唑（编号D7i）3 种化合物对辣椒根腐病菌的毒力测定结果见表3～6。从表3 ～6 可以看出，其3 种化合物对辣椒根腐病菌的毒力回归方程分别为y=2.7044 +1.4616x、y=3.9468 +0.8658x、y=2.8484 +1.1963x；建立该回归方程的相关系数（R）分别为0.9902、0.9940、0.9981，相关性较好；抑菌中质量浓度EC50分别为36.92 μg/mL、16.19 μg/mL、62.88 μg/mL。

表3 D7e 浓度梯度抑菌率

表4 D7k 浓度梯度抑菌率

表5 D7i 浓度梯度抑菌率

表6 三种新化合物对棉花枯萎病菌抑菌的毒力回归分析

根据EC50的大小，EC50值越小，表明毒力越大，3 种目标化合物对辣椒根腐病菌的毒力大小为：D7k ＞ D7e ＞ D7i。因此，N-(3,5- 二氯苄基 )-1H- 苯并咪唑（编号D7k）是12 种新型苯并咪唑类化合物中对辣椒根腐病菌毒力最大的化合物，最具有开发成为新型杀菌剂的潜力。

3 讨论

现在市场上广泛应用的苯并咪唑类杀菌剂，如多菌灵、苯菌灵、噻菌灵等，出现了较强的抗药 性[11]，对作物病害的杀菌防病效果大幅度下降，使用情况并不理想，而且有害物质残留也很严重，破坏生态系统，引发一系列环境污染问题[12]，开发应用新型苯并咪唑类杀菌剂迫在眉睫。

本研究测定出了这12 种新型苯并咪唑类化合物对辣椒根腐病菌的抑菌率和毒力，并筛选出最具有研发前景的3 种化合物，分别是N-(3,5- 二氯苄基 )-1H- 苯并咪唑、N-(3- 氯苄基 )-1H- 苯并咪唑和N-(3,4- 二氯苄基 )-1H- 苯并咪唑，为新的杀菌剂的研发提供了一定的科学依据,其安全性以及是否有残留还有待进一步研究。